動物諾如病毒的研究進展

2019-01-12 03:08

中國獸醫(yī)雜志 2019年12期

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002)

諾如病毒(Norovirus,NoV),為諾瓦克樣病毒屬,與札幌病毒屬、兔病毒屬、水皰疹病毒屬和紐布病毒屬同屬杯狀病毒科,是引起人及牛、豬、犬、貓、鼠、猴子等多種易感動物罹患急性胃腸炎的重要非細菌性病原之一。該病毒原型株于1972 年由美國學(xué)者Kapikian 用免疫電鏡技術(shù)從1968 年暴發(fā)的胃腸炎患者樣本中被發(fā)現(xiàn),主要經(jīng)糞—口途徑傳播,對人類和動物健康構(gòu)成一定的威脅。NoV 在遺傳性和抗原性方面都具有高度的變異性,不同基因型之間的基因重組頻繁發(fā)生,這對病毒的生存是十分有利的。NoV 的跨種間感染與傳播的潛在可能性及其相關(guān)公共衛(wèi)生學(xué)問題已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

1 病原學(xué)

諾如病毒是一種單股正鏈RNA 病毒,無囊膜,直徑約為27～32 nm。外殼是由180 個同一種外殼蛋白組成的90 個二聚體構(gòu)成。負染色電鏡照片顯示,NoV 具有典型的羽狀外緣,表面呈凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)病毒。

諾如病毒基因組全長約7.5 kb,編碼3 個開放閱讀框(Open reading frame,ORF),從5′端到3′端依次為ORF1、ORF2 和ORF3。其中,ORF1 主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,翻譯加工后的6 個蛋白分子(p48、NTP、p22、VPg、Pro、Pol),在病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。ORF2 編碼主要結(jié)構(gòu)衣殼蛋白VP1,VP1 是組成病毒顆粒的主要蛋白分子,有14 nt與ORF1 重疊;VP1 在功能上可分為外殼(S)區(qū)域和突起(P)區(qū)域,P 區(qū)域可與碳水化合物結(jié)合受體相互作用[1-2]。ORF3 編碼1 個小的病毒顆粒相關(guān)蛋白VP2,有1nt 與ORF2 重疊。

NoV 的基因和抗原性呈高度多樣性,根據(jù)病毒RNA 聚合酶和衣殼蛋白的核苷酸序列,將其分為GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI 和GVII 7 個基因群,進一步還可分為30 多個不同的基因型[3]及不同的變異株。其中,GI 群由8 個基因型組成,GII 群包含19個基因型,GIII 群和GIV 群各包含2 個基因型,GV群只包含1 個基因型。在相同基因型和不同的基因群之間病毒均可出現(xiàn)重組。不同種屬病毒之間的基因重組使病毒分型更加復(fù)雜,并可能促進重組病毒的跨種間傳播,其中包括從動物傳播到人。

NoV 是引起人類和多種動物腹瀉的重要病原之一,但由于目前尚無有效的預(yù)防和治療措施,每年都會造成巨大的直接和間接的經(jīng)濟和社會損失[4]。然而,隨著近年來NoV 體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)[5]、小鼠感染模型[6]的成功構(gòu)建以及鼠類NoV 功能受體[7]的發(fā)現(xiàn),將會在NoV 的組織嗜性和與共生菌相互作用等方面有較為深入的研究。NoV 可在多種動物的腹瀉糞便樣本中被檢測到,單獨或伴發(fā)多種其他常見的腸道病原[8]。

2 流行病學(xué)

NoV 迄今已在歐洲、美洲、亞洲和非洲的多個國家和地區(qū)流行和暴發(fā),成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一。在美國約有85%以上的急性非細菌性胃腸炎的暴發(fā)與NoV 有關(guān)。NoV 是全球引起急性病毒性胃腸炎暴發(fā)流行的主要病原體之一。NoV急性胃腸炎的高發(fā)季節(jié)為秋冬季,可累及任何年齡階段?；疾游?、隱性感染動物及健康帶毒動物均可為傳染源。糞—口為主要傳播途徑,也可通過嘔吐物的氣溶膠傳播。人為感染NoV 后,僅引起小腸絨毛輕度萎縮和黏膜上皮細胞的破壞,未見明顯的腸道損傷,但可導(dǎo)致長期腹瀉及排毒[9]。近年來,在我國多個省市流行[10-11],出現(xiàn)暴發(fā)流行的報道。

自20 世紀80 年代,在犢牛和豬的糞便樣本發(fā)現(xiàn)NoV 后,陸續(xù)在鼠、羊、犬、貓科動物、野生動物等動物中也檢測到了NoV。人的NoV 屬于GI、GII 和GIV,豬的NoV 為GII,反芻動物(牛和綿羊等)的NoV 為GIII,獅子和犬的NoV 為GIV,鼠的NoV 目前形成GV。但血清學(xué)證據(jù)顯示,也存在NoV GV 群感染其他動物的情況。因此,GV 可能在起源上不只屬于鼠源性。牛和豬NoV 可使血清反應(yīng)陰性的幼小動物產(chǎn)生腹瀉和厭食。最近在羊和犬中也發(fā)現(xiàn)了NoV,盡管這些病毒可能已在全球傳播,但它們作為病原體及其引起的疾病的重要性尚未得到重視。野生動物感染杯狀病毒案例已出現(xiàn),如1 頭4歲的幼獅被NoV 感染后死于嚴重的出血性胃腸炎。在矮小黑猩猩感染的口腔中分離到杯狀病毒,6 個月后又從該動物的喉拭子中再次分離到同樣的病毒,表明該病毒同貓杯狀病毒一樣可以持續(xù)存在。在其他物種中,推測是由杯狀病毒引發(fā)的感染也有報道,但在某些案例中尚不能肯定是有杯狀病毒導(dǎo)致發(fā)病的。隨著對更多物種尤其是野生動物研究的增加,會有更多的病毒歸類為杯狀病毒。

在眾多的基因型別中,GII4 是迄今為止報道的在世界范圍內(nèi)流行最為廣泛的基因型。利用人的NoV GII4 感染SPF 豬和牛,以小鼠感染鼠NoV 作為對照,發(fā)現(xiàn)人GII4 可感染SPF 豬和牛,可檢測到病毒的復(fù)制和陽性血清。Caddy S L 等[12]報道從寵物犬的樣本中分離到人NoV,Di Martino 等[13]在犬NoV 的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)NoV 可能在人類和犬中傳播。這些都說明NoV 存在從動物與人之間傳播的可能性,NoV 的預(yù)防和控制必須要考慮這點。在小狗和幼獅中發(fā)現(xiàn)的GIV 型NoV,及在狗中發(fā)現(xiàn)的GVI 型NoV 的報道均揭示在遺傳上相關(guān)的病毒可能會在更多的其他物種中發(fā)現(xiàn)[14]。人們已經(jīng)開始認識到犬、貓作為病毒、細菌和寄生蟲的載體在人獸共患病傳播中的作用,但作為腸道病毒的傳播媒介則往往被忽略。

由于NoV 的快速演化和病毒株系間的重組,新的病毒株系不斷演化產(chǎn)生[15],幾乎每隔1 -3 年就會出現(xiàn)新的變種并在世界范圍內(nèi)流行,因此提出“胃腸性流感”的概念:NoV 和流感病毒在進化和宿主免疫方面非常相似,流行優(yōu)勢株可進化獲得抗原空間并保持感染性而存活,具有導(dǎo)致大流行的潛能從而引起嚴重的社會公共衛(wèi)生問題。

3 診斷

NoV 感染的確診主要依靠實驗室檢測,其中最主要是通過病毒顆粒檢測、病毒核酸檢測、病毒蛋白質(zhì)檢測3 種方法來進行。

3.1 病毒顆粒檢測針對病毒顆粒常規(guī)的檢測方法是電鏡檢測,分為直接電鏡檢測法和免疫電鏡法。直接電鏡法可以檢測到直徑30 nm 左右的病毒顆粒,但要求病毒載量大。免疫電鏡法利用標(biāo)記的抗體通過表面抗原捕獲病毒顆粒,然后進行電子顯微鏡觀察,其檢出率遠遠高于直接電鏡法。電鏡檢測法是早期唯一的檢測NoV 的方法,可以直觀地觀察到病毒顆粒,但其在電鏡下形態(tài)學(xué)特征并不明顯,因此檢測結(jié)果并不準(zhǔn)確可靠,使得感染病例無法確診,且操作繁雜,靈敏度較低,不適合臨床檢測應(yīng)用。

3.2 病毒核酸檢測核酸檢測方法成為NoV 檢測中的常用方法,主要包括多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)和核酸探針雜交技術(shù)。PCR 技術(shù)如實時熒光定量PCR[16-17]、多重PCR,已廣泛應(yīng)用于NoV 的檢測,并成為NoV 診斷的金標(biāo)準(zhǔn),敏感性和特異性均較好。優(yōu)點在于可進一步對病毒進行基因型的研究,不會受到獲得分型單克隆抗體的限制,對流行病學(xué)研究具有重要意義。不足在于時間相對較長、價格較貴,尚有待于進一步研究更加快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

NoV 基因型復(fù)雜,不同型間的序列變化大,大多數(shù)檢查方法僅能針對一種或幾種型進行檢測,這在實踐應(yīng)用中受到了限制。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,尤其是PCR 技術(shù)的應(yīng)用,對NoV 的傳播特點(特別是跨物種傳播)、分布規(guī)律與遺傳演化規(guī)律的研究具有重要意義。同時,PCR 技術(shù)還促進了NoV 序列的積累,這不僅有助于了解病毒基因組特征,而且還加深了對其遺傳演化機制的認識。

3.3 病毒蛋白質(zhì)檢測病毒蛋白檢測方法主要是利用抗原抗體反應(yīng)來實現(xiàn)對病原體的檢測。該方法的靈敏度和特異性與抗原和抗體的親和力有很大關(guān)系。目前較常用的NoV 免疫學(xué)檢測方法包括:酶聯(lián)免疫吸附試驗,放射免疫法、生物素-親和素免疫法等。使用單克隆抗體捕獲樣品中的病毒抗原來進行檢測的方法(夾心ELISA)由于交叉反應(yīng)性小,特異性強且敏感度較高,成為研制NoV 檢測采用的主要方法。放射免疫法靈敏度比免疫電鏡法可提高10～100 倍,可檢出抗體消長水平;不足是耗時長,且需要放射性同位素標(biāo)記。生物素-親和素免疫法的靈敏度與放射免疫法相當(dāng)。

4 預(yù)防

NoV 具有基因組內(nèi)及基因型間高度變異的特性,使得疫苗無法有效交叉保護。病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP)可作為非復(fù)制型顆粒黏膜免疫的良好模型,利用基因充足來嵌合表達不同毒株的抗原決定簇,從而制備嵌合VLP 疫苗以期能在疾病暴發(fā)時表現(xiàn)強大的力量[18]。

研究VLP 的表面結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合域,有助于鑒定外源蛋白潛在的插入位點,將有助于提高VLP 組裝和結(jié)合受體的有效性。基于人和鼠NoV 的細胞培養(yǎng)研究,希望在不久的將來能有商品化的疫苗可以投入使用。但是,NoV 的快速演化為流行病學(xué)的研究和疫苗的研制提出了挑戰(zhàn),未來對NoV 疫苗的研究還需不斷努力。

在有效的疫苗使用之前,NoV 的預(yù)防措施應(yīng)遵循以切斷傳播途徑為主的原則,注意飼養(yǎng)衛(wèi)生、環(huán)境清潔、避免料源水源污染等,防止疾病的傳播和流行。

5 展望

目前,對NoV 的基因組、蛋白結(jié)構(gòu)及免疫機制方面有了相對較全面的認識。由于NoV 進化迅速,不能有效地培養(yǎng)及缺少恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ偷确N種原因,限制了人們對NoV 的深入研究。特別是在NoV的感染、致病機理、組織嗜性、病毒與宿主相互作用,靶細胞受體,在細胞內(nèi)的復(fù)制過程等基礎(chǔ)研究相對較少,這嚴重限制了人們對NoV 的認識。然而,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對NoV 分子生物學(xué)認識的不斷深入,以及NoV 體外培養(yǎng)和動物感染模型的逐步完善,相信未來的研究定能在致病機理方面有較大的突破,并探索出有效的預(yù)防和控制策略。然而,對我國NoV 的分子生物學(xué)特征,如病毒的全基因結(jié)構(gòu)、致病機理、病毒重組和進化等方面的了解并不多,故在這些方面很有必要進行更加深入地研究[19]。