徐倩倩 ,郭時金 ,王玉波 ,王艷萍 ,董 林 ,王金良 ,沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心,山東濱州256600 ;2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司,山東濱州256600 ;3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科,山東濱州 256600)

動物腸腔內(nèi)存在大量共生菌,這些細(xì)菌大部分有助于腸道功能的維持與健康[1]。然而,病原菌進(jìn)入腸道就會引起感染,腸道病原菌與宿主上皮細(xì)胞的相互作用多與毒素相關(guān)。產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(ETEC)是農(nóng)場動物大腸桿菌性腹瀉最常見的病原菌。ETEC 的致病性始于對宿主小腸上皮細(xì)胞的粘附,隨之而來的是腸毒素的分泌,引發(fā)急性水樣腹瀉,伴隨著炎癥和屏障功能的破壞。ETEC 能產(chǎn)生2類毒力因子,26 種粘附素使其在腸上皮細(xì)胞粘附和定植,3 種腸毒素引發(fā)液體分泌[2]。ETEC 產(chǎn)生的腸毒素與腸道上皮細(xì)胞相互作用能夠破壞腸道緊密連接,造成屏障功能障礙,水和離子以被動吸收的方式進(jìn)入腸腔,引發(fā)腹瀉。

1 緊密連接的結(jié)構(gòu)

胃腸道(GI)上皮細(xì)胞形成了機體與外界環(huán)境接觸的最大表面。相鄰細(xì)胞間有細(xì)胞間連接。細(xì)胞間連接的重要功能就是形成選擇性屏障[3]。腸細(xì)胞間通過4 種不同類型的連接互相結(jié)合。這些特殊的復(fù)合物包括緊密連接(Tight junctions,TJ)、粘附連接(Adherens junctions,AJ)、細(xì)胞橋粒和縫隙連接。頂端連接復(fù)合物的每個連接都是由3 個亞組件構(gòu)成:跨膜蛋白、細(xì)胞骨架部分和胞質(zhì)骨架蛋白。AJ 位于TJ 的底外側(cè),由跨膜蛋白E-鈣粘著蛋白與連環(huán)蛋白家族的胞質(zhì)蛋白相互作用形成。AJ 和細(xì)胞橋粒提供上皮細(xì)胞間強有力的粘合鍵,有利于細(xì)胞間信號傳導(dǎo),但不參與細(xì)胞滲透性調(diào)節(jié)。TJ 具有動態(tài)結(jié)構(gòu),是轉(zhuǎn)運支路的主要屏障。

TJ 是復(fù)合蛋白結(jié)構(gòu),包括跨膜蛋白,通過它連接于細(xì)胞骨架。4 個完整的跨膜蛋白,閉合蛋白、閉鎖蛋白、連接粘附分子(Junctional adhesion molecules,JAMs)和tricellulin,形成半滲透性屏障。這些跨膜蛋白與細(xì)胞質(zhì)骨架蛋白相互作用的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域,如閉鎖小帶(Zonula occludens,ZO)蛋白反過來將跨膜蛋白錨定到連接周圍肌動球蛋白環(huán)和肌動蛋白絲。胞漿蛋白將膜成分連接到細(xì)胞骨架并參與TJs 和細(xì)胞核間的信號傳導(dǎo)。TJs 通過細(xì)胞內(nèi)支架蛋白和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)分子構(gòu)成、超微結(jié)構(gòu)和功能。在細(xì)胞培養(yǎng)的感染性試驗中,通常將測定跨上皮細(xì)胞電阻抗(Transepithelial resistance,TER)作為屏障功能的評價指標(biāo)。屏障損壞對應(yīng)著TJ 屏障空隙的增多,伴隨著可見的分子通道,如葡聚糖、甘露醇和菊糖。然而,多孔性與TER 改變并非同步。

1.1 閉合蛋白 閉合蛋白是TJ 的主要成分和支柱。閉合蛋白在多種組織的屏障形成和細(xì)胞滲透性、選擇性方面都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前至少鑒定了27 種閉合蛋白[4]。閉合蛋白調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。在腸道,閉合蛋白-1、-3、-5、-8、-9、-11 和-14 為屏障形成閉合蛋白,而-2、-7、-12 和-15 則是孔形成閉合蛋白。這類蛋白的高表達(dá),會導(dǎo)致上皮細(xì)胞更加緊密、TER 增高、上皮細(xì)胞單層的不滲透性增強。閉合蛋白嚴(yán)格控制了陽離子和陰離子跨細(xì)胞流動。相鄰細(xì)胞間的閉合蛋白,有的能夠形成細(xì)胞間連接,而有些則不能。它們對于TJs 的屏障功能尤為重要。一些閉合蛋白是磷酸化的,磷酸化程度與其在細(xì)胞的定位和細(xì)胞滲透性有關(guān)。

1.2 閉鎖蛋白 閉鎖蛋白是一種完整的膜TJ 蛋白,呈現(xiàn)4 個跨膜域。閉鎖蛋白從TJ 向細(xì)胞質(zhì)囊泡的移動通常會導(dǎo)致屏障功能丟失改變上皮細(xì)胞通透性。閉鎖蛋白在TJ 結(jié)構(gòu)和腸上皮細(xì)胞屏障功能維持中發(fā)揮重要作用。閉鎖蛋白在TJ 內(nèi)一般是磷酸化狀態(tài),而在基底外側(cè)膜和胞漿中磷酸化狀態(tài)則較為少見。閉鎖蛋白長長的C-端域與多種細(xì)胞內(nèi)TJ 蛋白相互作用,如ZO 蛋白,將閉鎖蛋白連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上[5]。閉鎖蛋白在TJ 結(jié)構(gòu)和腸上皮細(xì)胞滲透性方面都發(fā)揮了重要作用,細(xì)胞外環(huán)與鄰近細(xì)胞相互作用,形了能阻擋大分子但不能阻擋小離子的屏障。

1.3 JAM JAM 家族屬于免疫球蛋白(IG)超家族,其特點為細(xì)胞外IG 域,1 個跨膜域和1 個細(xì)胞外域。JAS 參與多種功能,包括TJ 組裝、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運通透性調(diào)節(jié)[4]。

1.4 ZO 目前已鑒定了3 種ZO,包括ZO-1,ZO-2和ZO-3[4]。它們是細(xì)胞漿蛋白,為TJ 結(jié)構(gòu)的調(diào)整和維持所必須。ZOs 屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白大家族。ZOs 在TJ 的細(xì)胞質(zhì)側(cè)形成一種復(fù)合物。ZO-1 位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞TJ 等離子膜附近,與激動蛋白細(xì)胞骨架相互作用。ZO-2 和ZO-3 為外周蛋白,是ZO-1 的結(jié)合蛋白。許多TJ 蛋白結(jié)合于ZO蛋白N-末端區(qū)域,而C-末端區(qū)域與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用。在細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型中,ZO-1 都是位于初期細(xì)胞間的連接。據(jù)推測,ZO 蛋白可能介導(dǎo)TJ 蛋白的初期裝配并形成細(xì)胞間連接。

1.5 Tricellulin Tricellulin 是在3 個相鄰細(xì)胞間形成連接的TJ 蛋白。Tricellulin 是一種四分子交聯(lián)體蛋白,有4 個跨膜域和2 個細(xì)胞外環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),Tricellulin 在三細(xì)胞連接和兩細(xì)胞連接的上皮細(xì)胞TJ 調(diào)節(jié)中都發(fā)揮了重要作用。

1.6 肌動蛋白 肌動蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)對TJ 的功能至關(guān)重要。肌動蛋白細(xì)絲對于維持細(xì)胞形狀和上皮細(xì)胞屏障的完整性都非常重要。在極化細(xì)胞,頂端區(qū)域含有大量肌動蛋白微絲,它們以多種結(jié)構(gòu)存在。肌球蛋白和肌動蛋白形成一個環(huán)(連接周圍肌動蛋白肌球蛋白環(huán)),從TJ 和AJ 水平將細(xì)胞環(huán)繞[6]。

2 ETEC 腸毒素對TJ 的破壞

腸毒素是致病性微生物產(chǎn)生的蛋白或者肽,作用于消化道,特別是小腸上皮細(xì)胞,破壞其TJ 結(jié)構(gòu),導(dǎo)致柵欄和門控功能失效。主要產(chǎn)生熱不穩(wěn)定性毒素(Heat-labile toxin,LT) 和熱穩(wěn)定性腸毒素(Heat-resistant,ST)。ST 是低分子量毒素,能夠耐受100 ℃15 min,而LT 在60 ℃15 min 即可失活。這2 種毒素都是質(zhì)粒編碼,并且毒力特性可在大腸桿菌菌株之間轉(zhuǎn)移[7]。這些分子具有非常強的毒性,納摩級濃度甚至更低即可引起腸道穩(wěn)態(tài)的破壞。ETEC 菌株造成的感染,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞通透性屏障破壞,很難將這種破壞直接歸因于一種或幾種腸毒素,但卻都與K88 血清型有關(guān)[8]。

Egberts 等發(fā)現(xiàn)3 周大的仔豬人工感染ETEC(O145、K91、K88),與未感染的空白對照組相比,豬空腸上皮細(xì)胞TJ 數(shù)量明顯減少,TJ 鍵的排列變得松散,但對辣根過氧化物酶(MW=44 kDa)的通透性沒有發(fā)生變化,說明盡管連接的鍵數(shù)量減少,TJ的屏障功能沒有受到影響。也有研究發(fā)現(xiàn),仔豬感染ETEC 后,小腸對小分子的通透性增加,絨毛變短,隱窩加深,空腸閉鎖蛋白、ZO-1 和ZO-2 以及回腸閉合蛋白-1、ZO-1 和ZO-2 表達(dá)減少[9-10]。相反,Roselli 等[11]通過測定人Caco-2 細(xì)胞TER 發(fā)現(xiàn),豬ETEC 株(K88)降低TJ 通透性,使ZO-1 移位,并降低豬IPEC1 腸道上皮細(xì)胞閉鎖蛋白的豐度。

2.1 LT LT 是AB5 型高分子量毒素(大約85 kDa)。它在結(jié)構(gòu)、功能和作用機制方面與霍亂毒素(Cholera toxin,CT)都十分相似。LT 全毒素由一個酶促激活A(yù)(30 kDa)亞單位(ADP-ribosylating)結(jié)合于5 個受體結(jié)合B(11.5 kDa)亞單位構(gòu)成。A 亞單位包括含有活化位點的A1 片段和將A1 結(jié)合于B亞單位的A2 片段。LT-B 亞單位的受體在腸細(xì)胞廣泛存在,包括GM1 神經(jīng)節(jié)苷脂、GD1b,去唾液酸GM1、一些乳蛋白和含半乳糖糖脂。GM1 神經(jīng)節(jié)苷脂是LT-1 的首選受體。LT-1 通過B 亞單位與受體結(jié)合后,A 亞單位通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。通過逆行轉(zhuǎn)運,轉(zhuǎn)運至高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplamic reticulum,ER)。在高爾基體解體后,A亞單位轉(zhuǎn)移到ER,在此被剪切為A1 和A2 兩份。A1 片段轉(zhuǎn)移到胞液,導(dǎo)致腸細(xì)胞基底側(cè)膜腺苷酸環(huán)化酶激活[5]。腺苷酸環(huán)化酶的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP 蓄積,以及囊纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的活化,伴隨著蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)磷酸化。Cl-和HCO3-從這個開放的通道分泌。同時,PKA 通過鈉氫交換體3(Na+/H+-exchanger 3,NHE3)磷酸化抑制Na+被絨毛細(xì)胞再吸收。滲透壓作用導(dǎo)致水分泌增多,引發(fā)腹瀉。LT-1 的作用是不可逆的,可以被抗CT 抗體中和。

LT 對不同細(xì)胞株可能表現(xiàn)為不同的作用。豬ETEC 菌株明顯降低IPEC-J2 細(xì)胞的TER,未見TJ蛋白(ZO-1,ZO-2,ZO-3、閉合蛋白、閉鎖蛋白和JAMS)表達(dá)或者分布有明顯改變。推測TER 的改變可能歸因于ETEC 對宿主離子通道功能的作用而不是TJ。ETEC 菌株與極化T84 上皮細(xì)胞單層共培養(yǎng)3 h 可引起TER 下降[12],對于產(chǎn)LT 菌株,這種現(xiàn)象感染后48 h 出現(xiàn)逆轉(zhuǎn),而在產(chǎn)STa 菌株則未出現(xiàn)。LT 腸毒素不僅通過破壞TJ 引起T84 細(xì)胞單層TER 下降,還導(dǎo)致葡聚糖-FITC(4 kDa)通道破壞。弗斯可林(cAMP 誘導(dǎo)物)處理缺乏葡聚糖通道細(xì)胞說明LT 通過一種非cAMP 依賴性途徑引起對大分子的通透性。ADP -核糖基活性降低、LT-B 亞基減少突變證實TER 降低僅出現(xiàn)在單層細(xì)胞受功能性LT 腸毒素處理或者產(chǎn)LT ETEC 菌株處理后,伴隨著對FITC-葡聚糖通透性的增高。數(shù)據(jù)顯示,產(chǎn)LT ETEC 菌株誘導(dǎo)腸道通透4～67 kDa 分子的屏障功能障礙,該作用依賴于LT ADP-核糖基活性。

2.2 ST STs 是一類由一些大腸桿菌菌株產(chǎn)生的低分子量微粒。ETEC 主要產(chǎn)生兩類ST,為STa 和STb。STa 主要與人類腹瀉有關(guān),STb 在人類腹瀉病例中也有分離到,但主要引起動物腹瀉,特別是豬腹瀉[13]。

2.2.1 STa STa 是一種18-(豬STa)或者19-氨基酸(人STa)富含半胱氨酸肽,分子量大約2 000 Da。2 個亞類的氨基酸序列不同,但兩者都含有3 個二硫鍵。二者在仔豬體內(nèi)都有活性?？偲饋碚f,從氨基端半胱氨酸到羧基端半胱氨酸13 個氨基酸序列是其毒性的關(guān)鍵。STa 結(jié)合于腸道上皮細(xì)胞刷狀緣絨毛的糖蛋白受體鳥苷酸環(huán)化酶C(Guanylate cyclase C,GC-C)的細(xì)胞外區(qū)域。結(jié)合后,GC 細(xì)胞內(nèi)催化位點激活,導(dǎo)致cGMP 產(chǎn)生,并在細(xì)胞內(nèi)聚集。cGMP 水平增高激活cGMP 依賴性蛋白激酶Ⅱ,使得Cl-通道CFTR 磷酸化。CFTR 激活,導(dǎo)致Cl-和HCO3-分泌。cGMP 增高還會抑制磷酸二酯酶3(Phosphodiesterase 3,PDE3),增高了cAMP 水平,激活PKA。PKA 使CFTR 磷酸化,還可以使NHE3 磷酸化,抑制Na+的再吸收[13]。STa 的作用是可逆轉(zhuǎn)的。

STa 腸毒素與鳥苷酸,一種生理性的GC 激活劑,呈現(xiàn)相似的作用。STa 在4 μM 以上的濃度,培養(yǎng)2 h 即可造成T84 上皮極性細(xì)胞單層TER 的降低,但鳥酐蛋白卻不能;然而,利用FITC-葡聚糖(4 kDa)的轉(zhuǎn)運通道測定進(jìn)行評價時,STa 或者鳥酐蛋白均不能增加細(xì)胞通透性,說明STa 不僅增加水分泌,還會破壞屏障功能[14]。因為TER 下降的部分,濃度都在4 μM 以上,說明STa 引發(fā)TER 下降僅出現(xiàn)在有限的上皮細(xì)胞位點,可能是ETEC 粘附并且產(chǎn)生STa 毒素的位點。數(shù)據(jù)顯示STa 通過GC-C激活引發(fā)水分泌,同時在誘發(fā)腸道屏障障礙中也發(fā)揮了作用。STa 對TER 的作用研究雖然較少,但它可能在ETEC 的發(fā)病機理中占重要作用。

2.2.2 STb STb 為48 個氨基酸的肽,分子量為5 200 Da,2 個二硫鍵。這類毒素的序列和作用機制均與STa 無關(guān)。STb 無需激活腺苷酸或者GC 即可引發(fā)腹瀉。它與腸道上皮細(xì)胞的鞘糖脂,硫苷脂結(jié)合。STb 與其受體的結(jié)合引發(fā)內(nèi)吞作用,使其內(nèi)化。一旦進(jìn)入細(xì)胞,STb 即可激活GTP 結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白,Ca2+被攝入到細(xì)胞,激活CAMKⅡ,一種鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶。該酶使CFTR 磷酸化,引發(fā)Cl-和HCO3-分泌。細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高還可激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC),這種酶也作用于CFTR,并通過一種尚不明確的通道抑制Na+吸收。CAMKII 還能打開鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channel,CaCC)。同時,Ca2+水平的最初升高通過磷脂酶A2 和C 活化刺激膜脂促分泌素前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)合成。在腸嗜鉻細(xì)胞內(nèi),這些酶產(chǎn)生 5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT)。5-HT 作用于腸道神經(jīng)系統(tǒng),使腸壁平滑肌收縮,造成液體的排出。這些改變導(dǎo)致十二指腸和空腸分泌水和電解質(zhì)。STb 的作用是可逆的。

單獨用STb 毒素處理T84 極化細(xì)胞單層,能引起TER 顯著降低,而單個氨基酸突變(D30V)無生物學(xué)活性的肽則不能降低[15]。轉(zhuǎn)運通透性的增加與F-actin 張力纖維的巨大改變有關(guān)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),F-actin 細(xì)絲溶解和縮合伴隨著ZO-1,claudin-1 和閉鎖蛋白的重排和/或分裂。該結(jié)果與STb 中一段8 氨基酸肽處理細(xì)胞一致,也與霍亂弧菌Zot 毒素作用后一致,但與T84 細(xì)胞受雜亂肽處理結(jié)果不同。這個8 肽負(fù)責(zé)與STb 和Zot 毒素受體結(jié)合。對于Zot 毒素,該8 氨基酸序列還參與TJ 重排。因此,STb 引發(fā)TJ 開放,表現(xiàn)為TER 明顯下降,細(xì)胞對大分子量標(biāo)記物(FITC-BSA=47 kDa)通透性增加,與其導(dǎo)致TJ 蛋白重新分布和肌動蛋白細(xì)胞骨架重排有關(guān)。采用免疫印跡和共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)STb 處理后T84 細(xì)胞單層claudin-1 的重新分布[16],從膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中。同時,Dreyfus 等推測了鈣在STb 活性機制中的作用,在細(xì)胞培養(yǎng)基中增加Ca2+后,屏障功能的破壞速度明顯增加。膜claudin-1 的消失伴隨著去磷酸化?？傊?STb 處理導(dǎo)致claudin-1 在細(xì)胞的重新分布,從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)位點。TJ 膜claudin-1 磷酸化的消失可能導(dǎo)致了滲透性的增加。STb 通過改變TJ 蛋白造成上皮細(xì)胞屏障破壞,最終導(dǎo)致腹瀉。

3 展望

ETEC 是引發(fā)人類和幼畜腹瀉的重要原因。ETEC 產(chǎn)生各種LT 和ST 腸毒素通過對腸道上皮細(xì)胞TJ 產(chǎn)生破壞作用。很明顯,除了對離子通道的活性作用,毒素還影響到上皮細(xì)胞的通透性。在ETEC 感染引發(fā)水樣腹瀉中,ETEC 引發(fā)的TJ 破壞到底發(fā)揮了怎樣的角色仍需進(jìn)一步研究。從控制腸離子通道和保護(hù)TJ 的角度預(yù)防和治療ETEC 引發(fā)的腹瀉無疑也是一個突破點。