牛佳偉，魏杰

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 骨科，山西 太原 030001）

隨著現(xiàn)代城市化進(jìn)程的發(fā)展及我國老齡化的到來，骨折的發(fā)生率不斷攀升。在這些骨折中發(fā)生骨折延遲愈合或者不愈合占5%～10%，導(dǎo)致患者的康復(fù)周期延長從而增加患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及造成社會資源的浪費(fèi)[1]，因此進(jìn)一步了解骨折愈合的機(jī)制對于將來研究骨折不愈合的預(yù)防及治療至關(guān)重要。

骨折愈合過程大體分為骨折血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑型期。這3 個過程的任一階段的異常都會影響骨折的愈合從而導(dǎo)致骨折延遲愈合或者不愈合。骨折血腫炎癥機(jī)化期，創(chuàng)傷導(dǎo)致局部組織腫脹釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-3（Interleukin,IL-3）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor,TNF-α）等誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)[2]。隨著炎癥消退，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）和其他祖細(xì)胞增殖，形成肉芽組織，最終形成軟骨骨痂以穩(wěn)定骨折部位[3-4]。除提供機(jī)械穩(wěn)定性外，軟骨還具有為成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨沉積的支架功能，骨沉積加速骨痂礦化和骨折間隙的閉合[5-6]。然后破骨細(xì)胞吸收未成熟的編織骨和軟骨基質(zhì)，并且隨著成熟板層骨的沉積，骨被恢復(fù)到其骨折前的結(jié)構(gòu)和完整性[3-4]。而在這骨折的愈合過程中巨噬細(xì)胞都扮演著重要角色。

巨噬細(xì)胞分為M1、M2 兩大類型，分別發(fā)揮著促炎作用和抗炎作用。近年來，隨著對巨噬細(xì)胞研究的不斷深入，尤其是M2 型巨噬細(xì)胞及其亞型：M2a、M2b、M2c、M2d，作為治療型巨噬細(xì)胞而備受重視，這些亞型巨噬細(xì)胞除了具有強(qiáng)大的抗炎作用以外，還分別具有促進(jìn)細(xì)胞遷移增殖、細(xì)胞成熟、細(xì)胞外基質(zhì)形成和血管形成等重要功能[7-8]。此外，巨噬細(xì)胞也能調(diào)節(jié)其他干細(xì)胞以及成骨、破骨細(xì)胞的功能活性[9]。巨噬細(xì)胞的這些功能共同參與骨折的愈合過程。

本文對巨噬細(xì)胞的來源、極化及功能進(jìn)行綜述，重點(diǎn)討論巨噬細(xì)胞如何參與骨折的愈合。

1 巨噬細(xì)胞的來源、極化及功能

巨噬細(xì)胞分為循環(huán)巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞，都來源于骨髓造血細(xì)胞[10-11]。在骨髓中，前體巨噬細(xì)胞在一些細(xì)胞因子比如集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下逐漸發(fā)育成熟，最后釋放入血液循環(huán)。巨噬細(xì)胞的極化根據(jù)其功能不同而分類。在Toll 樣受體和干擾素-γ 作用下極化為M1 巨噬細(xì)胞，M1 巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的促炎作用，分泌促炎因子IL-3、IL-4、TNF-α 等促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12-13]。較M1 型巨噬細(xì)胞比較，M2 型巨噬細(xì)胞因亞型的極化相對較為復(fù)雜。IL-4/IL-13 的作用下極化為M2a，在免疫復(fù)合物的作用下極化為M2b，在IL-10 或轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor,TGF-β）的作用下極化為M2c，在A2AR 受體的作用下極化為M2d[7-8，14]。極化后，M2a 能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移、生長因子的產(chǎn)生和凋亡細(xì)胞清除；M2b 促進(jìn)細(xì)胞成熟、組織穩(wěn)定、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）合成；M2c促進(jìn)炎癥消退、組織修復(fù)、ECM 合成，并產(chǎn)生生長因子；M2d 促進(jìn)血管生成和傷口愈合[7-8，14]。巨噬細(xì)胞除了作為炎癥細(xì)胞外還參與骨髓干細(xì)胞的調(diào)節(jié)而加速骨折的愈合[9]。

2 巨噬細(xì)胞的招募

巨噬細(xì)胞參與骨折的愈合過程必須招募到損傷部位，這是參與骨折愈合的先決條件。招募需要趨化因子或蛋白質(zhì)的幫助。如果缺乏相應(yīng)的募集蛋白，巨噬細(xì)胞就不能完成其修復(fù)受損組織的功能。例如，在肌肉損傷中，需要AMP 激活蛋白激酶亞單位α1（AMP-activated protein kinase subunit alpha 1,AMPKa1）來募集巨噬細(xì)胞以促進(jìn)骨骼肌修復(fù)再生，并且AMPKa1敲除或突變后阻止巨噬細(xì)胞向M2 表型極化，從而使肌肉組織修復(fù)難以完成[15]。在骨折中，趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）及 其 受 體CCR2（C-C motif chemokine receptor 2,CCR2）是巨噬細(xì)胞招募的關(guān)鍵基因[2]。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除CCL2/CCR2 基因后或者變異后，骨折處招募到的巨噬細(xì)胞較野生型正常組明顯減少[16-17]，并且導(dǎo)致全身骨質(zhì)硬化，骨折無法愈合[16-17]。當(dāng)骨折時，在CCR2/CCL2 信號有效調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的運(yùn)動，CCR2/CCL2 信號精確調(diào)節(jié)下以及其他主要趨化因子如白血病抑制因子、IL-1α、IL-1β和胰腺炎相關(guān)蛋白Ⅲ共同作用下，巨噬細(xì)胞從骨髓進(jìn)入血液，然后從循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入損傷后的炎癥部位[18-20]。巨噬細(xì)胞被招募到損傷處后，巨噬細(xì)胞可分泌CCL2、TNF-α、IL-1α 和IL-1β 進(jìn)一步招募巨噬細(xì)胞[20-21]，巨噬細(xì)胞招募到骨折部位后為骨折的愈合做好準(zhǔn)備。

3 巨噬細(xì)胞在骨折愈合過程中的作用

不同于大多數(shù)脊椎動物的其他組織，它們通過形成疤痕組織愈合，而骨折愈合通過再生完成骨折修復(fù)，骨折愈合包括血腫炎癥機(jī)化期、原始骨痂形成期和骨痂改造重塑期3 個明顯但又互相重疊的階段。在第一階段，炎癥細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，浸潤和解脫損傷部位。同時，干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，形成新的軟骨和骨。軟骨隨后通過軟骨內(nèi)骨化過程被骨替代，然后對愈傷組織進(jìn)行重塑，直到獲得最佳的生物力學(xué)性能。而在骨折愈合過程中的每個階段都有巨噬細(xì)胞的參與，并扮演著重要角色。

3.1 巨噬細(xì)胞為骨折局部清創(chuàng)——血腫炎癥機(jī)化期

創(chuàng)傷導(dǎo)致骨折時，局部骨塊及周圍軟組織受到損傷而引起局部炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、血漿滲出、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，其中包括嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，再加上骨折處滲血而形成骨折周圍血腫。在血腫炎癥機(jī)化期，巨噬細(xì)胞被招募極化成不同的亞型參與炎癥反應(yīng)。如上所述，除M1 巨噬細(xì)胞激活后，通過上調(diào)清道夫受體CD36，顯示出其強(qiáng)大的吞噬碎片和細(xì)菌的能力以及殺菌作用，從而加速異物的清除[22]。M2a、M2b 和M2c 細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子，并增加細(xì)胞增殖、遷移和組織重塑，以及生長因子的分泌[23-24]。因此，當(dāng)巨噬細(xì)胞繼續(xù)處于M1 狀態(tài)時，受損組織持續(xù)處于炎癥和慢性創(chuàng)傷狀態(tài)[25]。如前所述，巨噬細(xì)胞是促進(jìn)組織修復(fù)的多功能調(diào)節(jié)器[22]。M1 巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，從而加重炎癥反應(yīng)和組織壞死，同時也加強(qiáng)了M1 的吞噬功能。相反，M2 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，加速組織修復(fù)，有研究將M2 作為治療靶標(biāo)加速組織的修復(fù)[18]。因此在骨折愈合的炎癥階段，M1 和M2 型巨噬細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用為骨折周圍行清創(chuàng)術(shù)。

3.2 巨噬細(xì)胞為骨折愈合提供營養(yǎng)——原始骨痂形成期

損傷立即引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，在所有炎癥細(xì)胞中，只有巨噬細(xì)胞能感覺到缺氧[26]，在這種情況下，它會引起缺氧反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α）穩(wěn)定并轉(zhuǎn)錄。通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子等[26]誘導(dǎo)血管生成的誘發(fā)反應(yīng)。早期研究表明，巨噬細(xì)胞通過分泌VEGF-A[26]促進(jìn)血管生成，維持內(nèi)皮細(xì)胞的健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管新生的基礎(chǔ)，為骨組織修復(fù)和再生提供營養(yǎng)。巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP2）[27]，BMP2 在體外已被證明以自動調(diào)節(jié)的方式控制其他BMP 的活性[27]。由于BMP2 在體內(nèi)的早期表達(dá)，也提示BMP2 可能啟動其他BMP 的產(chǎn)生，從而刺激骨組織的形成。此外，由于巨噬細(xì)胞極化成不同的亞型，可以釋放細(xì)胞因子加速血管生成，例如，M2d巨噬細(xì)胞分泌IL-10、VEGF，促進(jìn)血管生成和血管修復(fù)[26]。此外，M1 和M2 巨噬細(xì)胞促使MSC 向成骨方向分化[9]。而MSC 具有多項(xiàng)分化潛能，在巨噬細(xì)胞及其分泌的因子作用下使骨折愈合能力明顯增強(qiáng)[9]。

3.3 巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)成骨、破骨活性——骨痂改造塑型期

骨痂改造塑形是原始骨痂中新生骨小梁逐漸增粗，排列逐漸規(guī)則和致密。骨折端的壞死骨經(jīng)破骨和成骨細(xì)胞的侵入，完成死骨清除和新骨形成的爬行替代過程。原始骨痂被板層骨所替代，使骨折部位形成堅強(qiáng)的骨性連接，該過程需要1～2年。而骨痂塑型的關(guān)鍵就是維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能活性[28-29]。而巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性和功能，對骨痂的塑型發(fā)揮著重要作用。M1 型巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成潛力，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞的作用[28-29]。當(dāng)骨壞死時，TNF-α 高表達(dá)而使周圍M1 巨噬細(xì)胞大量增多[28-29]。隨著骨壞死的進(jìn)一步進(jìn)展，骨壞死區(qū)的TNF-α 表達(dá)降低，此時骨壞死區(qū)聚集大量的M2 型巨噬細(xì)胞，抑制壞死物質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)而為骨壞死后的再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境[29]。

成骨細(xì)胞的增殖和分化受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，如生長因子、TGF-β、骨生成蛋白等[30-31]，而巨噬細(xì)胞能分泌這些因子來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化。因此，巨噬細(xì)胞能介導(dǎo)原始骨痂整形。

4 巨噬細(xì)胞在骨折不愈合中的潛在應(yīng)用

近年來，隨著骨折不愈合患者的不斷增多，給臨床的治療帶來了挑戰(zhàn)。臨床中形成骨折不愈合的原因是多方面的，且較為復(fù)雜，有患者本身因素，也有疾病因素，還有技術(shù)因素，諸多因素中，骨折不愈合患者的根本原因是骨折經(jīng)相應(yīng)的治療后局部的血供不足，使得骨折局部缺乏營養(yǎng)而導(dǎo)致骨折延遲愈合或者不愈合[9]。目前對于骨折不愈合的治療有多種方法，包括自體骨移植、更換固定方式、自體骨髓移植、中醫(yī)中藥等。而手術(shù)是首先方法，其目的就是使得骨折不愈合處周圍的硬化骨組織重新獲得血液供應(yīng)，重啟正常的骨愈合過程[32]。

除上述提到的治療方法以外，骨組織工程也成為研究治療骨折不愈合的熱點(diǎn)。目前，該研究主要基于骨髓MSC 的骨組織工程研究治療骨折不愈合[33]。因?yàn)楣撬鐼SC 具有分化為骨、軟骨和血管等多重分化功能，并且易于獲取以及體外擴(kuò)增，因此在基于骨髓MSC 的骨組織工程為骨缺損或骨折不愈合的治療帶來新的希望。相比之下，迄今為止很少有研究利用巨噬細(xì)胞或靶向巨噬細(xì)胞-MSC 共同作用來增強(qiáng)骨再生治療骨折不愈合。然而，隨著巨噬細(xì)胞在骨再生中的關(guān)鍵作用日益被重視，以增強(qiáng)骨折愈合為目標(biāo)的治療方案也開始出現(xiàn)。有文獻(xiàn)指出，通過靶向巨噬細(xì)胞-MSC 的共同作用，明顯地增強(qiáng)骨再生能力，提高骨折不愈合的治療效果。增加骨折部位巨噬細(xì)胞的數(shù)量和調(diào)節(jié)局部巨噬細(xì)胞極化以增強(qiáng)骨再生[9]。在臨床上，自體骨髓通常用于治療骨折不愈合和骨壞死[34]。盡管這些策略的主要目標(biāo)是將骨髓成骨細(xì)胞輸送到損傷部位，但這些治療也不可避免地含有大量的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系和其他細(xì)胞，實(shí)際上可以認(rèn)為它是利用巨噬細(xì)胞在骨折愈合中的強(qiáng)大作用來治療骨折不愈合[9]。后來有研究表明，將IL-4 和IL-13 浸在膠原蛋白支架處，可使骨截骨局部的骨痂生成及骨再生能力明顯增強(qiáng)[35]。

5 總結(jié)和展望

巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性炎癥細(xì)胞之一。許多研究表明巨噬細(xì)胞被招募到損傷部位并參與骨折的愈合過程。有研究指出，在骨折愈合過程中巨噬細(xì)胞具有清理組織碎片，抗炎，促進(jìn)血管生長以及調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能活性，不僅在骨折愈合中起重要作用，而且可以作為治療靶點(diǎn)，在骨折不愈合的治療中具有潛在的應(yīng)用價值。巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞具有雙重性質(zhì)，一方面使炎癥和組織壞死加劇，另一方面抗炎保護(hù)組織和促進(jìn)修復(fù)。在骨折愈合的炎癥反應(yīng)階段，M1 巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，從而加重炎癥反應(yīng)和組織壞死，同時也加強(qiáng)M1 的吞噬功能。相反，M2 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)。然而，在骨折愈合的血腫炎癥階段，M1 和M2 巨噬細(xì)胞的協(xié)調(diào)作用才能為骨折清創(chuàng)，隨后分泌相關(guān)細(xì)胞因子為骨痂形成提供營養(yǎng)，最終介導(dǎo)骨痂的塑形。

雖然巨噬細(xì)胞在骨折愈合的過程中扮演著重要角色，但是在骨折不愈合的治療過程中利用其作為治療靶點(diǎn)仍然不被重視。而骨折不愈合治療的根本目標(biāo)就是改善局部的血供，而巨噬細(xì)胞是唯一能感知缺氧的炎癥細(xì)胞，并釋放血管生成因子促進(jìn)血管生成，改善局部血供。然而，目前利用巨噬細(xì)胞治療骨折不愈合的研究甚少，在未來的研究中如果實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞作為靶向細(xì)胞來治療骨折不愈合，或許將極大地促進(jìn)骨折的愈合，改善愈后。尤其是在骨組織中，利用巨噬細(xì)胞作為種子細(xì)胞，輸送到不愈合骨折處；或者是支架材料上復(fù)合上巨噬細(xì)胞的趨化因子和/或極化因子，提高局部巨噬細(xì)胞的含量，從而加速骨折愈合。這些都有待于進(jìn)一步研究。當(dāng)然對血供較差的骨折部位，在局部注入巨噬細(xì)胞積極預(yù)防骨折不愈合的發(fā)生也不失為一個良好的選擇。但是對巨噬細(xì)胞輸入到血供較差的部位時細(xì)胞量、細(xì)胞亞型都需要進(jìn)一步研究，確定多少細(xì)胞量、哪個亞型能更好地促進(jìn)骨折愈合。