秦佳星 牛勃 王建華

一、神經(jīng)管畸形

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生起源于神經(jīng)外胚層，由神經(jīng)管和神經(jīng)嵴分化而成。人胚第3周初，在脊索突和脊索的誘導(dǎo)下，出現(xiàn)了由神經(jīng)外胚層構(gòu)成的神經(jīng)板。隨著脊索的延長，神經(jīng)板也逐漸延長并形成神經(jīng)溝。神經(jīng)溝逐漸向頭、尾兩端閉合成神經(jīng)管，并在頭、尾兩端形成前神經(jīng)孔和后神經(jīng)孔。胚胎第25天左右，前神經(jīng)孔閉合；第27天左右，后神經(jīng)孔閉合，完整的神經(jīng)管形成。之后神經(jīng)管的前段發(fā)育為腦，后段發(fā)育為脊髓[1]?；蛉毕莺?或環(huán)境因素均可能造成神經(jīng)管閉合障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)[2,3]，包括無腦畸形(常伴有顱頂骨發(fā)育不全，稱露腦)、腦膨出、脊柱裂等[1]，發(fā)病率為0.05%～1%，可造成孕婦流產(chǎn)、圍產(chǎn)兒和嬰兒死亡或終身殘疾，危害極大，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟與精神負(fù)擔(dān)。NTDs的發(fā)病差異可能是由不同的風(fēng)險因素導(dǎo)致，如營養(yǎng)狀況、肥胖、糖尿病、葉酸補充、環(huán)境毒物以及不同種群中的遺傳易感性[4]?？傮w而言，盡管研究已經(jīng)確定了許多危險因素，但這些因素在NTDs發(fā)生過程中的確切機制尚有待于進一步研究。明確NTDs發(fā)生機制，做到早期預(yù)防很重要。大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬在神經(jīng)管畸形發(fā)生過程中發(fā)揮著很重要的作用。

二、細(xì)胞自噬

1.細(xì)胞自噬簡介：自噬是真核細(xì)胞內(nèi)通過一雙層膜細(xì)胞器結(jié)構(gòu)進行自我消化、自我清除和獲得營養(yǎng)的復(fù)雜過程，使細(xì)胞在饑餓、氧化應(yīng)激等狀態(tài)下能存活下來。這一過程受到一系列自噬相關(guān)蛋白(autophagy related proteins，Atg蛋白)的調(diào)控[5-7]，可以是選擇性地去除細(xì)胞中有害或不必要的物質(zhì)，也可以是非選擇性的[8]。自噬過程異常與神經(jīng)變性[9]、癌癥[10]、衰老[11]和感染[12]等疾病關(guān)系密切。

哺乳動物細(xì)胞中存在3種自噬途徑：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperonr-mediated autophagy，CMA)[13,14]。巨自噬是真核細(xì)胞中通過起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的雙層膜結(jié)構(gòu)形成的自噬體，包被蛋白質(zhì)聚集體、損傷或衰老的線粒體和過氧化物酶體等，并將其轉(zhuǎn)運到溶酶體進行消化降解[15]。微自噬是溶酶體膜包裹胞質(zhì)成分后內(nèi)陷，進行消化降解，沒有形成自噬體[16]。CMA則是依靠特定的受體與靶向基序的特異性識別，對胞質(zhì)內(nèi)容物進行選擇性運輸降解，運輸過程中不形成中間囊泡或進行膜融合[6,17]。

2.細(xì)胞自噬分子機制：細(xì)胞自噬核心成分主要由4種大分子物質(zhì)組成，即Unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)復(fù)合物、III類磷脂酰肌醇3-激酶(class III phosphatidylinositol 3-kinase，PI3KIII)復(fù)合物、泛素化修飾系統(tǒng)及跨膜蛋白[15]。ULK1復(fù)合物由ULK1、自噬相關(guān)蛋白13(autophagy-related protein 13,Atg13)、分子量大小為200 kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白(FAK family interacting protein of 200 kDa，F(xiàn)IP200)和Atg101組成，受調(diào)控分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)調(diào)節(jié)[16,18-19]。PI3KIII 復(fù)合物由Vps34、Beclin1、Vps15、Atg14組成，通過產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3 phosphate，PI3P)來啟動自噬體的形成[20]。泛素化修飾系統(tǒng)包括Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)連接系統(tǒng)，作用于隔離膜的延長和自噬泡的形成。跨膜蛋白Atg9可通過影響膜泡運輸調(diào)控自噬[20-21]。

營養(yǎng)條件充足，自噬未啟動時，mTORC1通過磷酸化ULK1和Atg13使ULK1復(fù)合物失活，AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)-mTORC1-ULK1信號通路下傳中斷，從而阻斷自噬。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)磷酸酶形成，將mTORC1去磷酸化使其失活，對ULK1和Atg13磷酸化作用終止，使得ULK1和Atg13去磷酸化，促使ULK1復(fù)合物的激活[20]。激活的ULK1復(fù)合物磷酸化Beclin1和自噬/芐氯素1調(diào)節(jié)因子1(activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1，Ambra1)，Ambra1促進Beclin1和Vps34的相互作用，使PI3KIII 復(fù)合物形成和活化[14,22]。此外，活化的ULK1介導(dǎo)PI3KIII 復(fù)合物運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)，其中Vps34催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)轉(zhuǎn)化為PI3P，募集自噬體形成所需的特定自噬蛋白，促使杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬前體形成[16]。隨后，自噬前體延伸包裹待降解底物，形成完全閉合的自噬泡。自噬泡通過Atg9系統(tǒng)運輸達(dá)到溶酶體，其外膜最終與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體。最后，自噬溶酶體的內(nèi)容物被溶酶體水解酶消化[16,21]。

3.細(xì)胞自噬與NTDs：自噬是一種很強的分解代謝過程，是胚胎發(fā)育過程中快速的細(xì)胞重構(gòu)所必須的，可以通過環(huán)境和激素刺激誘導(dǎo)發(fā)生?；A(chǔ)水平的自噬可以降解受損的細(xì)胞器和長壽蛋白質(zhì)；相反，過度活躍的自噬可能干擾細(xì)胞的生理過程，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，干擾正常的胚胎發(fā)生[23]。Fimia 等[8]發(fā)現(xiàn)哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育需要自噬，細(xì)胞生長和細(xì)胞死亡之間復(fù)雜的相互作用。當(dāng)自噬損傷積累到一定的程度將導(dǎo)致NTDs的發(fā)生。Wang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除編碼自噬負(fù)調(diào)控的Prkcα基因，可以逆轉(zhuǎn)糖尿病誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬損傷和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致NTDs減少。許多研究表明，自噬相關(guān)基因AMBRA1缺失導(dǎo)致大量的神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡和NTDs的形成[13,15,22-25]。

三、 AMBRA1基因與NTDs

1.AMBRA1基因結(jié)構(gòu)及功能：AMBRA1基因編碼Ambra1蛋白。人類AMBRA1基因位于11p11.2染色體上，包含23個外顯子，編碼的蛋白質(zhì)分子量為142 kDa，包含1 298個氨基酸殘基。小鼠Ambra1基因位于2號染色體上，包含19個外顯子，編碼的蛋白質(zhì)分子量為143 kDa，包含1 300個氨基酸殘基。Ambra1蛋白是脊椎動物細(xì)胞中一種保守的蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞骨架、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、溶酶體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與神經(jīng)元發(fā)育期間自噬調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)運以及細(xì)胞生存與增殖的調(diào)控。該蛋白質(zhì)在N端區(qū)有一個特征性的WD40結(jié)構(gòu)域可以通過為大分子復(fù)合物的組裝提供空間，介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-肽和蛋白質(zhì)-DNA之間的相互作用而參與不同的細(xì)胞功能(包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分裂和RNA加工)。這種特征可能使Ambra1在自噬的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)以及自噬與其他途徑之間廣泛的相互作用中起到重要作用[26]。

2.AMBRA1基因與NTDs：小鼠胚胎中Ambra1缺陷會導(dǎo)致胚胎發(fā)育早期自噬損傷，細(xì)胞增殖過度，隨后細(xì)胞凋亡增加和泛素化蛋白在神經(jīng)上皮中積聚，導(dǎo)致嚴(yán)重的NTDs[8]。Ambra1缺陷導(dǎo)致小鼠在胚胎發(fā)育10.5天(embryonic day 10.5，E10.5)到胚胎發(fā)育13.5天(E13.5)之間出現(xiàn)露腦畸形和脊柱裂，胚胎發(fā)育16.5天(E16.5)胚胎致死[8]。類似地，在斑馬魚中，抑制ambra1a和ambra1b會導(dǎo)致嚴(yán)重胚胎畸形及相關(guān)的不完全發(fā)育。受精后2天(2 days post-fertilization,2dpf)，呈現(xiàn)廣泛的中腦和后腦室腦積水，并產(chǎn)生異常頭部和較小的眼睛。在3dpf時，表型進一步惡化，最終導(dǎo)致ambra1a敲除動物心臟水腫和胚胎死亡，ambra1b敲除動物在4dpf死亡[27]。因此，Ambra1在細(xì)胞自噬、凋亡、增殖過程中發(fā)揮著重要作用，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中控制細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活的必需蛋白質(zhì)。AMBRA1基因突變可導(dǎo)致NTDs[13,15,22-23]。

在營養(yǎng)豐富的條件下，細(xì)胞自噬過程被抑制，mTORC1除了通過直接磷酸化ULK1對自噬進行負(fù)調(diào)控，還可以通過結(jié)合并磷酸化Ambra1抑制ULK1的泛素化，阻止ULK1的自我結(jié)合，降低ULK1的穩(wěn)定性和活性，從而對自噬通路進行微調(diào)[28]。此外，在人成纖維細(xì)胞2FTGH中Ambra1還與Beclin-1和PI3KIII一起與動力蛋白復(fù)合物的動力蛋白輕鏈(dynein light chains，DLC)結(jié)合，阻止PI3KIII復(fù)合物移動至ER，導(dǎo)致自噬前體無法形成，抑制細(xì)胞自噬[26]。當(dāng)營養(yǎng)條件缺乏，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生時，mTORC1活性受到抑制，Ambra1激活促進ULK1的泛素化，增強了ULK1的自我結(jié)合，使其活性與穩(wěn)定性進一步提高[15]。激活的ULK1又磷酸化與Beclin-1、PI3KIII和DLC結(jié)合的Ambra1，使Ambra1從動力蛋白復(fù)合物中釋放，促進了Beclin-1和Vps34的相互作用，并介導(dǎo)PI3KIII復(fù)合物轉(zhuǎn)運至ER，促進自噬體的形成，形成一正反饋調(diào)節(jié)通路[26]。

Antonioli 等[29]發(fā)現(xiàn)，在人成纖維細(xì)胞2FTGH的自噬反應(yīng)過程中，Ambra1的穩(wěn)定性還可被泛素/蛋白酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)；磷酸化的Ambra1使Cullin-4與Ambra1解離，導(dǎo)致Cullin-4通過損傷特異性DNA 結(jié)合蛋白1(damage- specific DNA binding protein 1，DDB1)介導(dǎo)的Ambra1降解作用被終止；釋放的Ambra1又可以通過結(jié)合ElonginB抑制Cullin-5活性，減少Cullin-5對mTOR抑制劑DEPTOR的降解而使DEPTOR含量增加，增強對mTOR活性的抑制，促進細(xì)胞自噬。

Ambra1還在線粒體自噬調(diào)節(jié)中起作用。當(dāng)線粒體損傷，線粒體膜電位下降明顯增加了Parkin與Ambra1的相互作用，Ambra1以Parkin依賴的方式被募集到去極化線粒體周圍，激活PI3KIII復(fù)合物并促進其通過自噬途徑清除[22]。此外，Ambra1-LC3相互作用可以將受損的線粒體轉(zhuǎn)運到自噬體，對放大Parkin介導(dǎo)的線粒體清除是至關(guān)重要的[30]。

四、展望

AMBRA1基因通過其編碼的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)自噬過程，自噬對胚胎神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要。目前發(fā)現(xiàn)AMBRA1基因突變與神經(jīng)管發(fā)育密切相關(guān)，并已經(jīng)確定Ambra1可以通過很多途徑對自噬進行調(diào)控，但仍有一些調(diào)節(jié)過程機制不清。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，Ambra1在神經(jīng)管畸形形成過程中的作用將有可能被逐一闡明，這將有利于NTDs的防控和治療。