張鵬 張蝶 唐森

摘 ? ? ?要：以羊蹄甲果莢為原料，乙醇為提取溶劑，通過單因素和正交試驗對回流提取羊蹄甲果莢總黃酮工藝進行優(yōu)化;并通過考察羊蹄甲果莢總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除能力來評價其抗氧化性。結(jié)果表明，羊蹄甲果莢總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間5 h、料液比1∶30 （g∶mL）、提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)80%。在此優(yōu)化工藝條件下，提取液中總黃酮含量為10.837 mg·g-1。羊蹄甲果莢總黃酮對DPPH自由基（IC50=34.511μg·mL-1）和羥基自由基（IC50=0.090 mg·mL-1）具有一定的清除作用，表明其具有一定的體外抗氧化活性。

關(guān) ?鍵 ?詞：羊蹄甲;總黃酮;正交試驗;提取工藝;抗氧化性

中圖分類號：R 284.2 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2019）12-2717-07

Abstract： Using mature seedpods of Bauhinia purpurea as raw material， and ethanol as extracting solvent， based on the results of single factor tests， the conditions of reflux extraction of total flavonoids in seedpods of Bauhinia purpurea were optimized by orthogonal tests.The antioxidant activity of total flavonoids from seedpods of Bauhinia purpurea were evaluated by investigating its scavenging capacity for 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·） and hydroxyl free radical（·OH）. The best extraction process parameters of total flavonoids were determined as follows： the ethanol concentration 80%， the extraction temperature 80 ℃， the ratio of solid to liquid 1：30，the extraction time 5 h.Under these extraction conditions， the contents of total flavonoids in the extract was 10.837 mg·g-1.The antioxidant tests results indicated that scavenging capacity （IC50） of total flavonoids towards DPPH· and ·OH were 34.511 μg·mL-1 and 0.090 mg·mL-1， respectively， which indicated that the total flavonoids had strong antioxidant activity.

Key words： Bauhinia purpurea; Total flavonoids; Orthogonal test; Extraction process; Antioxidant activity

黃酮類化合物（flavonoids）是以2-苯基色原酮為基本母核而衍生成的一類天然有機物質(zhì)，以C6-C3-C6為基本骨架，廣泛存在于自然界植物組織中的次生代謝產(chǎn)物[1]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)在預(yù)防心腦血管疾病、老年性癡呆等方面有明顯療效，還有治療腹瀉、抗炎癥、抗真菌、抗腫瘤、保護肝臟、治療糖尿病、增強身體免疫力、消除自由基等功效，且毒性較低[2]，因此可作為天然添加劑，用于食品、保健品和化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域。

羊蹄甲（Bauhinia purpurea）隸屬于豆科（Leguminosae）、羊蹄甲屬（Bauhinia），是廣泛栽培于我國華南地區(qū)的園林綠化喬木植物[3]。羊蹄甲的花朵、葉子、莖稈和樹根均可入藥，具有健脾祛濕和止血等功效，常用于醫(yī)治消化不良、急性胃腸炎、肝炎、咳嗽咯血、關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷等疾病[4]。羊蹄甲果莢是收獲羊蹄甲種子后的剩余廢棄物，常被作為垃圾來焚燒處理或于自然環(huán)境中慢慢分解，造成該生物質(zhì)資源的浪費。研究結(jié)果表明，同屬于豆科的一些植物的果莢中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[5-12]，而關(guān)于羊蹄甲果莢總黃酮的提取工藝及抗氧化性研究卻鮮有報道。因此，研究羊蹄甲果莢總黃酮的提取及生物活性，對提高羊蹄甲資源的綜合利用具有十分重要的意義。

本研究以羊蹄甲果莢為試驗材料，基于單因素試驗的結(jié)果，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化羊蹄甲果莢總黃酮的提取工藝條件;同時，選取L-抗壞血酸（Vc）為陽性對照藥，以羊蹄甲果莢總黃酮對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性來評價其體外抗氧化活性。以期為羊蹄甲果莢黃酮類物質(zhì)的進一步研究及其在醫(yī)藥工業(yè)等方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?實驗部分

1.1 ?材料與試劑

羊蹄甲果莢：采自廣西科技師范學(xué)院校園內(nèi)，為8至9月份種子成熟后的褐色果莢，去除種子，將果莢洗凈后置于45 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，粉碎后過80目篩，粉末裝密封袋置于陰涼干燥處儲存?zhèn)溆?蘆丁標準品（純度≥98%，批號：F8525，山東西亞化學(xué)服務(wù)有限公司）;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、石油醚、氫氧化鈉、L-抗壞血酸、水楊酸、七水合硫酸亞鐵均為國產(chǎn)分析純，30%過氧化氫，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）[凱瑪生化（天津）有限公司]，所用水均為蒸餾水。

1.2 ?儀器與設(shè)備

FW177 中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;GZX-GF101-3BS 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）;UV-2600 島津紫外可見分光光度計[島津企業(yè)管理（中國）有限公司];HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）;SHZ-D（Ⅲ） 循環(huán)水多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）;R-1001VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;KQ-300DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;FA-2004B 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?總黃酮提取工藝流程

羊蹄甲果莢→45 ℃烘干→粉碎→過80目篩→石油醚（沸程30 ～ 60 ℃）脫脂→揮干溶劑→稱量（2 g）→回流提取→抽濾→減壓濃縮→總黃酮提取液。

1.3.2 ?蘆丁標準曲線的繪制

采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法測定總黃酮含量[6，13]。準確稱取純度為≥98%的蘆丁標準品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL刻度線，從而得到濃度為1.0 mg·mL-1的蘆丁標準品溶液。分別精密移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL蘆丁標準品溶液于10 mL具塞刻度試管中（將9支具塞刻度試管依次編號為0至9號管），每管分別加入0.5 mL質(zhì)量體積分數(shù)為5%的NaNO2溶液，充分搖勻并靜置6 min，再向每管分別加入質(zhì)量體積分數(shù)10%的Al（NO3）3溶液0.5 mL，充分搖勻并靜置6 min，再向每管分別加入4.0 mL質(zhì)量體積分數(shù)4% NaOH溶液，然后用蒸餾水將每管定容至10 mL刻度線，充分搖勻并靜置15 min。

以0號具塞刻度試管為空白對照組，用分光光度計在最大吸收波長510 nm處分別測定0至9號管蘆丁溶液的吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，與其相對應(yīng)的吸光度值（A）為縱坐標用統(tǒng)計學(xué)軟件做散點圖，通過線性回歸擬合得到蘆丁質(zhì)量濃度C（mg·mL-1）與溶液吸光度值A(chǔ)之間的線性回歸方程為A=11.505C-0.011 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。表明蘆丁標準樣品濃度在0.010 ～ 0.080 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 ?提取液總黃酮含量的測定

1.3.4 ?單因素試驗

以提取液中總黃酮含量為試驗指標，分別考察提取時間、料液比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)4個單因素對羊蹄甲果莢總黃酮提取效果的影響：（1）準確稱取羊蹄甲果莢粉末2.0 g，固定乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶30 （g∶mL），提取溫度為70℃，考察回流提取時間分別為1、2、3、4、5、6 h的條件下提取液中總黃酮含量的差異;（2）準確稱取羊蹄甲果莢粉末2.0 g，固體乙醇體積分數(shù)70%，提取溫度70℃，提取時間4 h，考察料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 （g∶mL）的條件下提取液中總黃酮含量的差異;（3）準確稱取羊蹄甲果莢粉末2.0 g，固定乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30 （g∶mL），提取時間4 h，考察回流提取溫度分別為40、50、60、70、80、90℃的條件下提取液中總黃酮含量的差異;（4）準確稱取羊蹄甲果莢粉末2.0 g，固定料液比為1∶30 （g∶mL），提取溫度70℃，提取時間4 h，考察乙醇體積分數(shù)分別為40、50、60、70、80、90%的條件下提取液中總黃酮含量的差異。

1.3.5 ?正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以羊蹄甲果莢總黃酮含量為試驗指標，以提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、乙醇體積分數(shù)（D）為試驗考察因素，用L9（34）標準正交試驗設(shè)計表尋求羊蹄甲果莢總黃酮最優(yōu)提取工藝參數(shù)，正交試驗方案的試驗因素及水平設(shè)置見表1。

1.3.6 ?總黃酮抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除活性[14，15]

DPPH·一般在無水乙醇或乙醇-水溶液中可處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中所存在的孤對電子在可見光區(qū)517 nm處有強烈的光譜吸收。具有DPPH·清除能力的物質(zhì)可以與DPPH·結(jié)構(gòu)中的孤對電子進行配對結(jié)合，將穩(wěn)定的DPPH·轉(zhuǎn)化為黃色的DPPH，從而使溶液在波長517 nm處的光譜吸收減弱，甚至消失。因此通過測定光譜吸收減弱的程度可以間接判定被測物質(zhì)的DPPH·清除能力。

準確稱取19.7 mg DPPH，用無水乙醇溶解定容于250 mL容量瓶中，配制成濃度為0.2 mmol·L-1 DPPH工作液。取不同濃度梯度的總黃酮溶液2 mL分別加入10 mL具塞刻度試管中，再向每管加入0.2 mmol·L-1 DPPH工作液2 mL，搖勻后放于陰暗處靜置30 min，然后在517 nm處分別測定上述溶液的吸光度值，記為A1;另取2 mL不同濃度梯度的總黃酮溶液與無水乙醇2 mL置于10 mL具塞刻度試管中，搖勻，避光靜置30 min后在517 nm處測定吸光度值，記為A2;取0.2 mmol·L-1 DPPH溶液2 mL與無水乙醇2 mL置于具塞試管中，搖勻，放陰暗處30 min后在517 nm處測定吸光度值，記為A0。用無水乙醇作參比，以Vc為陽性對照進行相同實驗。取3次平行實驗測定的平均值。以測試樣品濃度為自變量，DPPH·清除率為因變量做散點圖并進行線性擬合，計算IC50值。定義IC50值為自由基清除率為50%時樣品的濃度，濃度越低，表明該樣品的抗氧化性越強[16]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

（2）羥基自由基清除活性[17]

Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH與水楊酸反應(yīng)生成在可見光區(qū)510 nm處有強烈光譜吸收的有色化合物2，3-二羥基苯甲酸。如果向溶液中加入的待測物質(zhì)具有清除·OH能力，就會減少2，3-二羥基苯甲酸的生成，從而使吸收減弱，甚至消失，因此測定溶液在510 nm處光譜吸收減弱的程度可以反映被測物質(zhì)的·OH清除能力。

精確稱取固體FeSO4 0.1390 g，用蒸餾水溶解后定容至50 mL容量瓶，制備成濃度為10 mmol·L-1的FeSO4溶液。精確稱取水楊酸0.0691 g，用無水乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶，制備成濃度為10 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液。精確量取30% H2O2溶液0.045 mL置于50 mL的容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，得濃度為8.8 mmol·L-1 H2O2溶液。移取不同濃度梯度的黃酮溶液1 mL于10 mL具塞刻度試管中，依次分別加入10 mmol·L-1 FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol·L-1過氧化氫溶液1 mL，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比在510 nm處測定溶液吸光度值，記為A1;另取成濃度梯度總黃酮溶液1 mL于10 mL具塞刻度試管中，依次分別加入10 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL和蒸餾水1 mL，在37 ℃水浴中反應(yīng)30min，在510 nm處測定溶液吸光度值，記為A2;取蒸餾水1 mL于10 mL具塞刻度試管中，依次分別加入10 mmol·L-1 FeSO4溶液1 mL、10 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1mL、8.8 mmol·L-1 H2O2溶液1 mL，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在510 nm處測其吸光度值，記為A0。以Vc為陽性對照進行相同實驗。取3次平行實驗測定的平均值。以樣品濃度為自變量，以·OH清除率為因變量做散點圖并進行線性擬合，計算IC50值。羥基自由基清除率計算公式如下：

1.4 ?數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Office Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理;用Origin 2018軟件繪圖;用Minitab 16.0軟件對正交試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗

2.1.1 ?提取時間對總黃酮提取效果的影響

由圖1可知，在提取時間為1 ～ 6 h內(nèi)總黃酮含量隨著提取時間的增加呈現(xiàn)出先緩慢升高，然后逐漸降低的趨勢。當(dāng)提取時間為4 h時，總黃酮含量達到峰值，9.586 mg·g-1。這可能是因為一定時間范圍內(nèi)黃酮類物質(zhì)的浸出量隨著提取時間的延長而增加;但當(dāng)提取時間超過4 h后，由于提取時間過長，一方面無用的雜質(zhì)成分也隨著浸出來，另一方面長時間的高溫提取會破壞黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性[18]。故確定提取時間為4 h。

2.1.2 ?料液比對總黃酮提取效果的影響

由圖2可知，羊蹄甲果莢總黃酮隨著提取溶劑用量的增大呈現(xiàn)出增大的趨勢，當(dāng)提取溶劑體積為原料質(zhì)量的30倍時，總黃酮含量達到峰值，9.682 mg·g-1。之后總黃酮含量隨著提取溶劑用量的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。這可能是，當(dāng)料液比達到1∶30 （g∶mL）時，原料中的黃酮類物質(zhì)已基本溶出，繼續(xù)提高提取溶劑用量會增大提取液中其他雜質(zhì)成分的溶出量，干擾總黃酮含量的測定，所以黃酮含量緩慢下降[19]。此外，溶劑使用量過大會為減壓濃縮操作帶來不便。故確定料液比為1∶30 （g∶mL）。

2.1.3 ?提取溫度對總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取溫度在40～90 ℃范圍內(nèi)的升高，羊蹄甲果莢總黃酮含量先緩慢增大再減小，在提取溫度為80 ℃時，總黃酮含量達到最大值9.547 mg·g-1。在提取溫度高于80 ℃后，總黃酮含量下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在一定溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，各種物質(zhì)的分子運動速度加快，提取溶劑的滲透、擴散速度加快、黃酮類物質(zhì)溶解速度加快，所以黃酮含量逐漸升高[19]。但回流提取溫度過高，會破壞熱穩(wěn)定性差的黃酮類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)而且會使其他非黃酮類物質(zhì)溶出，影響提取效果。故確定提取溫度為80 ℃。

2.1.4 ?乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取效果的影響

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)在40% ～ 90%范圍內(nèi)，總黃酮含量隨乙醇體積分數(shù)的增大呈先上升后下降的趨勢，乙醇體積分數(shù)為70%時總黃酮含量達到峰值，9.715 mg·g-1。這可能是體積分數(shù)為70%的乙醇溶液與羊蹄甲果莢總黃酮有較好的親和能力，促使黃酮類物質(zhì)最大限度地溶出[20，21]。故確定乙醇體積分數(shù)為70%。

2.2 ?正交試驗

由表2可知，影響總黃酮提取效果的因素主次順序依次為D（乙醇體積分數(shù)）>C（提取溫度）>A（提取時間）>B（料液比）。通過極差分析結(jié)果可知，果莢總黃酮最優(yōu)回流提取工藝組合為A3B2C2D3，即乙醇體積分數(shù)為80%，提取溫度為80 ℃，提取時間為5 h，料液比位1∶30 （g∶mL）。因為最佳提取參數(shù)組合未出現(xiàn)在正交試驗設(shè)計表中，因此，需要在該條件下做驗證試驗，重復(fù)5次，測定羊蹄甲果莢總黃酮平均含量為10.837 mg·g-1，大于正交試驗結(jié)果中的最大含量9.698 mg·g-1，表明該方法準確，重復(fù)性好，適于羊蹄甲果莢總黃酮的提取。

由表3可知，A（提取時間）、C（提取溫度）、D（乙醇體積分數(shù)）3個因素對總黃酮提取效果有極顯著影響（P<0.01），B（料液比）對試驗結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。

2.3 ?總黃酮抗氧化性分析

2.3.1 ?DPPH自由基清除能力評價

依據(jù)前述試驗方法，將總黃酮和Vc分別配制成一系列濃度梯度的樣品溶液并測定各自DPPH·清除率，通過計算不同抗氧化劑的IC50值來評價羊蹄甲果莢總黃酮的抗氧化性。如圖5（a）所示，當(dāng)濃度低于70 μg·mL-1時，總黃酮對DPPH·清除率呈線性關(guān)系增加，當(dāng)濃度大于70 μg·mL-1時，清除率增加趨勢變平緩，所以選取總黃酮溶液濃度范圍為0 ～ 70 μg·mL-1對其DPPH·清除率進行線性擬合。如圖5（b）所示，R2=0.992 3，表明擬合得到的回歸方程線性關(guān)系良好。如圖5（c）和5（d）所示，Vc也有類似結(jié)果。

計算出總黃酮IC50值為34.511 μg·mL-1，Vc的IC50值為7.471 μg·mL-1，雖然羊蹄甲果莢總黃酮清除DPPH·能力弱于Vc，但其作為混合物仍然表現(xiàn)出較強的抗氧化性。

2.3.2 ?羥基自由基清除能力評價

依據(jù)前述試驗方法，將總黃酮和Vc配制成一系列濃度梯度的樣品溶液并測定各自的·OH清除率，通過計算不同抗氧化劑的IC50值來評價總黃酮的抗氧化性。如圖6（a）所示，在質(zhì)量濃度低于0.14 mg·mL-1時，總黃酮對·OH清除率呈線性關(guān)系增加，但當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.14 mg·mL-1時，·OH清除率上升趨勢變緩，所以選取質(zhì)量濃度在0～0.14 mg·mL-1范圍內(nèi)的·OH清除率進行線性擬合。如圖6（b）所示，R2=0.991 3，表明擬合后所得回歸方程的線性關(guān)系良好。如圖6（c）和6（d）所示，Vc也有類似結(jié)果。

依據(jù)上述方法計算出總黃酮IC50值為0.090 mg·mL-1，Vc的IC50值為0.061 mg·mL-1。雖然羊蹄甲果莢總黃酮其清除·OH能力弱于Vc，但其作為混合物仍然表現(xiàn)出較強的抗氧化性。

3 ?結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到羊蹄甲果莢總黃酮最佳回流提取工藝條件為提取時間5 h、料液比1∶30 （g∶mL）、提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)80%。在此最優(yōu)條件下經(jīng)5次重復(fù)驗證試驗得到羊蹄甲果莢總黃酮平均含量為10.837 mg·g-1。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，羊蹄甲果莢總黃酮對DPPH自由基和羥基自由基具有較強的清除能力，IC50值分別為34.511 μg·mL-1和0.090 mg·mL-1，說明其具有一定的體外抗氧化活性。

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