劉 清，黃士文，倪 穗

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮(zhèn)農(nóng)辦，浙江 慈溪 315318)

荸薺種楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)也稱“余姚楊梅”，原產(chǎn)地是浙江余姚，屬于楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica)的喬木植物。因果實(shí)成熟時(shí)色澤呈紫黑色像荸薺而得名。其果實(shí)具有圓潤飽滿，味鮮色美、適應(yīng)性廣、豐產(chǎn)等特點(diǎn)，被推廣到南方其他省區(qū)，引種進(jìn)貴州被稱為“科技楊梅”；在江西被叫作“雜交楊梅”；在云南又名為“大樹楊梅”。楊梅果實(shí)具生津止渴、利消化的作用，其根、莖、葉在民間廣為藥用，用于治療痢疾、腹瀉、直腸出血、風(fēng)濕痛、胃痛及心血管疾病等癥[1-2]。楊梅的果實(shí)、樹葉和樹皮均可入藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。古代醫(yī)書記載楊梅葉味苦、微辛、性溫，可用于治療腹瀉、黃膽肝炎、淋巴結(jié)核、慢性咽喉炎等疾病[3-4]。浙江省是楊梅種植大省，楊梅葉作為一種可以快速生長的再生資源，資源豐富。同時(shí)為調(diào)節(jié)生長與結(jié)實(shí)的關(guān)系，促進(jìn)楊梅的持續(xù)、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，每年都需對(duì)楊梅樹進(jìn)行整形修剪，因而產(chǎn)生大量廢棄楊梅枝葉，而楊梅葉的精油的也具有較大的研究價(jià)值，楊梅葉精油不僅具有抑菌、消炎的功效，此外還有抗氧化、抗腫瘤活性[5-6]。開發(fā)利用楊梅葉資源，不僅解決了廢物處理所帶來的環(huán)境污染問題，而且增加了楊梅的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

本文采用新鮮、陰干、微波干燥、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥5種不同方法對(duì)荸薺種楊梅葉進(jìn)行干燥處理，再用水蒸氣蒸餾法提取楊梅葉的精油，并應(yīng)用GC-MS技術(shù)分離和鑒定了獲得的精油的組成成分，分析了不同的干燥處理方法對(duì)楊梅葉精油的得率及成分的影響。研究結(jié)果將為綜合開發(fā)和利用楊梅葉資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 儀器與設(shè)備

水蒸氣蒸餾裝置、電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；多功能粉粹機(jī)(上海江信科技有限公司)；電磁爐(浙江納德科學(xué)儀器有限公司)；DHG型智能電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海成順儀器儀表有限公司)；變頻智能電陶爐(中山市諾潔仕電器有限公司)；實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

于2017年3月在浙江省慈溪市橫河鎮(zhèn)楊梅種植楊梅園圃內(nèi)的100多年樹齡荸薺種楊梅樹上采摘完整無蟲害的二年生葉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 楊梅葉干燥處理

①鮮葉；②微波干燥：取楊梅葉子在微波爐中采用中高火微波加熱4 min。③自然陰干：取楊梅葉子在室內(nèi)陰干，每日翻動(dòng)3次，直至完全陰干。④鼓風(fēng)干燥：取楊梅葉在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，設(shè)置溫度60 ℃，干燥12 h。⑤真空冷凍干燥：取楊梅葉在真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行-50 ℃預(yù)凍，-48 ℃冷凍干燥48 h。

1.3.2 楊梅精油提取

分別取新鮮、微波干燥、自然陰干、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥的楊梅葉適量，粉碎，置于5 000 mL圓底燒瓶，按照料液比1∶7加入蒸餾水，按照《中國藥典》中植物揮發(fā)油的測定法(《中國藥典》附錄XD)[7]，在揮發(fā)油提取裝置中加熱回流提取7 h，停止加熱，得到油水混合物，分離后收集精油，取適量的無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，以100 g楊梅葉含精油的質(zhì)量計(jì)算得率。每組重復(fù)三次，取均值。

取適量精油用正己烷1∶100溶解稀釋為1%，用于GC-MS分析。樣品測定前均置于4 ℃下貯存。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

1.4.1 氣相色譜條件

VOCOL (1.80 μm×0.32 mm×60 m)柱，柱溫以40℃起始，并以10 ℃/min 升溫到210 ℃，保持40 min；載氣為高純 He(99．999%)，載氣總流量 44.0 mL/min，柱流量1.00 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL (用將樣品稀釋的溶液)，分流比40∶1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI源，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為210 ℃，溶劑延遲0.6 min，質(zhì)量范圍45～350 amu。Nist 5標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工檢索解析鑒定樣品中化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用美國NIST’98數(shù)據(jù)庫和揮發(fā)性成分的GC-MS定性譜庫對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。揮發(fā)油成分GC含量的確定為面積歸一化法。

2 研究結(jié)果

2.1 不同處理方法的楊梅葉精油感官與得率

不同方法干燥的楊梅葉其精油性狀基本一致，但得率不同，見表1。

表1 不同處理方法的楊梅葉精油測定結(jié)果 mL·(100g)-1

如表1可知，不同干燥方法處理的楊梅葉提取得到的精油均為黃綠色澄清透明液體，而且都有一股濃郁醇厚的香味。其中楊梅精油得率最高是經(jīng)過真空冷凍干燥處理的葉子，其得率為0.133%，其次是鼓風(fēng)干燥0.122%，得率最少的是鮮葉僅為0.058%。

由SPSS 19.0分析鼓風(fēng)干燥處理和冷凍干燥處理的精油得率差異性分析，P=0.422>0.05，無顯著性差異，即可知在精油得率無顯著性差異時(shí)可選擇耗能較少的鼓風(fēng)干燥作為楊梅葉干燥方法。

2.2 不同處理方法對(duì)精油成分的影響

對(duì)鮮葉、微波干燥、自然陰干、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥5種不同處理方法所得的荸薺種楊梅葉精油進(jìn)行了GC-MS檢測，分別得到總離子流色譜圖，分別鑒定出了33、43、40、39、40個(gè)化合物，占總量的96.45%、96.1%、97.14%、97.28%、67.87%。

表2 不同干燥方法處理的楊梅葉揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表2

續(xù)表2

從表2可見，5種處理的楊梅葉精油組成中有19種共有成分，分別占含量的80.84%、78.7%、54.75%、84.78%、51.43%；其中共有成分中順-4-環(huán)戊烯-1,3-二醇的含量最高分別為48.44%、39.8%、17.95%、52.37%、15.38%。

微波干燥與鮮葉處理方法相比共有23種共有成分，分別占相對(duì)含量的82.37%、80.57%；自然陰干與鮮葉處理方法相比共有24種共有成分，分別占相對(duì)含量的95.31%、69.25%；鼓風(fēng)干燥與鮮葉處理方法相比共有20種共有成分，分別占相對(duì)含量的86.02%、82.34%；真空冷凍干燥與鮮葉處理方法相比共有18種共有成分，分別占相對(duì)含量的52.54%、82.08%。

每種處理方法都存在特有的物質(zhì)。其中鮮葉精油和冷凍干燥楊梅葉精油中主要以烯烴、烷烴類為主。鮮葉精油共10種特有的物質(zhì)：如3-甲基-1-十六烯0.16%、正十九烷0.21%、β-蒎烯氧化物0.01%等。冷凍干燥楊梅葉精油特有成分共有15種，如新植二烯0.12%、順-α-紅沒藥烯0.04%、β-欖香烯0.01%、香樹烯0.02%、2-十三(碳)烯醛0.2%等。

在微波干燥的楊梅葉精油特有成分中酮類、醛類、烷烴、萘和烯烴等都有少量的存在，如0.01%的2,6-二甲氧基苯乙酮、0.01%的α-松油醇、0.02%的1,1,6三甲基-1,2二氫萘、0.16%的1,5-二甲基-2,3-二乙烯基環(huán)己烷、0.07%的α-亞甲基-2-甲酰基-3甲基-環(huán)戊基乙醛和0.02%環(huán)化小茴香烯等共有11種特有的物質(zhì)。

在自然陰干的楊梅葉精油中特有物質(zhì)是2,5-二氫呋喃其含量達(dá)到26.97%，此外還存在一些以酯類、烯萜類等共8種特有的物質(zhì)：如0.1%的順式-3-己烯醇苯甲酸酯、0.18%的氧化香樹烯以及0.01%的羅勒萜等。

鼓風(fēng)干燥楊梅葉精油中以醇類、烯醛為主要的特有的物質(zhì)，其中醇類以反式-橙花叔醇含量達(dá)到10.35%；烯醛類有0.1%的2,6,10-三甲基-9-烯-十一醛等。還有0.01%的(E,Z)-假紫羅蘭酮和0.02%的(1à,4aà,8aà)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-7甲基-4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-萘等共10種。

綜上，不同的處理方法對(duì)精油成分和含量的影響較大。5種處理方法的楊梅葉精油主要成分大致相同但含量不同，且在不同的處理方法中，精油都存在著各自特有的物質(zhì)。

3 分析討論

3.1 不同處理的荸薺種楊梅葉的精油性狀一致得率不同

不同方法干燥的楊梅葉精油性狀基本一致，均為黃綠色澄清透明液體，而且都有一股濃郁醇厚的香味。鮮葉、微波干燥、自然陰干、鼓風(fēng)干燥、真空冷凍干燥5種方法處理的楊梅精油得率分別是0.058%、0.083%、0.113%、0.122%、0.133%。研究結(jié)果和楊君等人[8]在東魁楊梅葉精油的提取中以料水質(zhì)量比1∶7, 蒸餾時(shí)間為7 h的條件下, 得出楊梅葉精油的提取得率達(dá)0.129%的研究結(jié)果差異不大，其中的差異可能由楊梅葉的品種不同造成精油得率稍有差異。

3.2 荸薺種楊梅葉的干燥處理可選用鼓風(fēng)干燥方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，真空冷凍干燥的楊梅葉精油得率高，鼓風(fēng)干燥次之。但是真空冷凍干燥，耗能較大，而且需要特別的設(shè)備。因此，實(shí)際應(yīng)用中可以結(jié)合節(jié)能和易操作的理念，選擇較為合適的干燥方法。經(jīng)顯著性分析鼓風(fēng)干燥處理和冷凍干燥處理的荸薺中楊梅葉精油得率無顯著性差異，在實(shí)際應(yīng)用中可選擇耗能較少的鼓風(fēng)干燥作為楊梅葉干燥的最佳方法。

3.3 不同干燥處理的楊梅葉精油成分有差異

不同的處理方法對(duì)提取的楊梅葉精油成分和含量有一定的影響。獲得的的楊梅葉精油主要由萜醇、萜烯類化合物組成，但成分均有一定差異，且不同的處理的楊梅葉獲得的精油都存在著各自特有的物質(zhì)。

5種處理的楊梅葉精油組成中有19種共有成分，分別占含量的80.84%、78.7%、54.75%、84.78%、51.43%；其中共有成分中順-4-環(huán)戊烯-1,3-二醇的含量最高分別為48.44%、39.8%、17.95%、52.37%、15.38%。說明了這19種物質(zhì)是構(gòu)成楊梅葉揮發(fā)油的主要成分。

對(duì)于鮮葉中特有的偶氮叔丁烷、棕櫚酸甲酯、正十九烷、正十八烷、欖香醇等共9種成分的存在，是因?yàn)轷r葉沒有經(jīng)過任何處理，精油中的物質(zhì)成分結(jié)構(gòu)沒有被破壞，最大化的保留了精油中原始成分；微波干燥的楊梅葉精油中特有的1,5-二甲基-2,3-二乙烯基環(huán)己烷、1,1,6三甲基-1,2二氫萘等11種成分的存在，是由于微波和高溫對(duì)楊梅葉精油的成分造成了組分的變化；自然陰干的楊梅葉精油中特有的2,5-二氫呋喃、羅勒萜等共8種成分的存在，是在室溫的條件下，楊梅葉與空氣接觸發(fā)生氧化，造成楊梅葉中精油存在特有的酮、酯、萜類物質(zhì)。鼓風(fēng)干燥的楊梅葉精油中特有的(1à,4aà,8aà)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-7甲基-4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-萘和微波干燥的楊梅葉精油中的1,1,6三甲基-1,2二氫萘可能是由于高溫對(duì)精油組分的分解催化重組而成的萘類物質(zhì)，其他幾種常溫、低溫的干燥方式處理的楊梅葉精油并沒有產(chǎn)生特有的萘類物質(zhì)。真空冷凍干燥的楊梅葉精油成分中存在著最多的特有成分共15種，表明真空冷凍干燥在真空狀態(tài)下隔絕了楊梅葉精油的與氧氣的接觸，同時(shí)冷凍低溫對(duì)精油的烯類成分的保留有促進(jìn)作用。從表1和表3中可以看出真空冷凍干燥的精油得率最高、成分含量做多，但是考慮到真空冷凍干燥在實(shí)際應(yīng)用中的能耗大和設(shè)備復(fù)雜、操作繁瑣等問題，本文建議采用鼓風(fēng)干燥，操作簡便，能耗較低。

研究結(jié)果與楊君[5]炭梅葉精油的主要化學(xué)成分石竹烯、葎草稀2種成分占78.41%，東魁楊梅葉精油葎草烯、石竹烯、氧化喇叭茶烯-(Ⅱ)、γ-雪松烯等主要成分占67%相比較有很大的差異。表明不同的品種的楊梅葉精油主要成分相差很大。同時(shí)與劉寧[9]等人的矮楊梅葉精油化學(xué)成分研究相對(duì)比，同樣是采用水蒸氣蒸餾法提取精油，但是劉寧試驗(yàn)的油樣不經(jīng)過任何處理直接用GC-MS進(jìn)行分析，測定的成分與本試驗(yàn)也有著很大的差異性，表明油樣的處理對(duì)其化學(xué)成分也有一定的影響。本研究與徐元芬[10]等研究GC-MS測定荸薺種楊梅果實(shí)的化學(xué)成分，所取樣地方、采用的色譜柱、GC條件、MS條件不同，表明產(chǎn)地和實(shí)驗(yàn)采用的色譜柱、GC條件、MS條件對(duì)精油化學(xué)成分的影響很大。

本文采用了5種處理方法對(duì)比研究了楊梅葉精油的得率、成分，綜合實(shí)際情況認(rèn)為選擇溫度60℃，干燥12 h的鼓風(fēng)干燥為荸薺種楊梅葉精油提取最佳的干燥處理方法。研究結(jié)果荸薺種楊梅葉的開發(fā)利用提供的技術(shù)支持。