鄭佳逸,辛貴忠，劉麗芳

(中國(guó)藥科大學(xué)，天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

威靈仙為毛茛科鐵線(xiàn)蓮屬植物威靈仙ClematischinensisOsbeck)、棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮(ClematishexapetalaPall.)或東北鐵線(xiàn)蓮(ClematismanshuricaRupr.)的干燥根和根莖[1]，具有祛風(fēng)除濕、止痛通絡(luò)等功效。其單方和復(fù)方制劑在臨床上都有廣泛的應(yīng)用，主要可用于風(fēng)濕痹痛、肢體麻木，筋脈攣急、屈伸不利等癥狀，具有抗菌消炎、止痛解痙、抗腫瘤、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化及心肌梗死等藥理活性[2-4]。威靈仙所含化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要包括三萜皂苷類(lèi)[5-6]、黃酮及多元酚類(lèi)[7-8]、內(nèi)酯和生物堿類(lèi)[9-10]，此外還有一些多糖類(lèi)成分[11-12]、揮發(fā)性成分[13-14]、以及原白頭翁素[15]和白頭翁素[16]等。其中，三萜皂苷已被證實(shí)是威靈仙藥材的主要活性成分，亦是威靈仙藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。因此，本文將介紹我國(guó)藥典收載的不同來(lái)源威靈仙藥材中三萜皂苷類(lèi)成分的分布情況，同時(shí)對(duì)其治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行概述，為科學(xué)利用威靈仙藥材、開(kāi)展威靈仙藥材的成分分析、并對(duì)三種威靈仙藥材進(jìn)行基原和真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。

1 皂苷類(lèi)化學(xué)成分的研究

國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)《中國(guó)藥典》收載的三種不同來(lái)源威靈仙中的三萜皂苷類(lèi)成分進(jìn)行了一系列分離純化研究，從威靈仙中分離得到40余種三萜皂苷類(lèi)成分，從東北鐵線(xiàn)蓮中分離得到17種三萜皂苷類(lèi)成分，但是關(guān)于棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮中三萜皂苷類(lèi)成分的報(bào)道較少，僅找到了7種并且這7種都是與其他兩種所共有的成分(表1)。此外，從威靈仙和東北鐵線(xiàn)蓮中分離得到的三萜皂苷類(lèi)成分在種類(lèi)及含量上均有所不同[2, 17]，表明三種基原威靈仙藥材中的三萜皂苷類(lèi)成分存在著一定的差異。

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，根據(jù)苷元類(lèi)型大致可將威靈仙中的三萜皂苷分為四類(lèi)，包括齊繳果酸型(oleanolic：Ole)、常春藤皂苷元(hederagenin：Hed)、表常春藤皂苷元(epihederagenin：Epi)和絲石竹苷元(gypsogenin：Gyp)。大部分的威靈仙三萜皂苷苷元為Ole和Hed型，少數(shù)為Epi和Gyp型[3, 18]。這四類(lèi)皂苷元的基本骨架都為齊墩果烷型，只是在C-23和/或C-24位取代的基團(tuán)有所差別。Hed型、Epi型和Gpy型皂苷元的取代方式分別為C-23處連有—OH，C—24處連有—OH和C—23處連有—C=O。而Ole型皂苷元的C-23和C-24僅連有—CH3(圖1)。

威靈仙三萜皂苷類(lèi)成分側(cè)鏈糖的取代種類(lèi)多樣，其中大部分在C-3和C-28位均有糖鏈取代，少數(shù)只在C-3或C-28位取代單糖鏈。此外，有一些皂苷還有異阿魏?；?Isoferuloyl, IF)，對(duì)甲氧基桂皮?；?P-methoxy cinnamyl, MC)和3,4-二甲氧基桂皮酰基(3,4-dimethoxy cinnamyl, DMC)取代在C-28位的糖鏈上，且這幾種基團(tuán)常連接在位于糖鏈近末端的葡萄糖基團(tuán)上[24-25]。糖鏈中結(jié)合的糖主要包括有鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)和木糖(Xyl)[3,24-25](圖2，表1)。

圖1 威靈仙三萜皂苷四種苷元結(jié)構(gòu)式

表1 三種威靈仙所含三萜皂苷類(lèi)成分

續(xù)表1

續(xù)表1

注：A：具有單個(gè)糖鏈的皂苷；B：具有兩個(gè)糖鏈但不包含特殊取代基的皂苷；C：具有特殊取代基的雙糖鏈皂苷。W：威靈仙ClematischinensisOsbeck.；D：東北鐵線(xiàn)蓮ClematismanshuricaRupr.；M：棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮ClematishexapetalaPall.

圖2 威靈仙三萜皂苷糖鏈(A)和取代基(B)結(jié)構(gòu)

2 威靈仙皂苷類(lèi)成分治療關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究

2.1 抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的作用機(jī)制研究

盡管威靈仙治療關(guān)節(jié)炎已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制尚不明確，三萜皂苷類(lèi)成分作為其發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)其抗關(guān)節(jié)炎的藥理作用機(jī)制進(jìn)行了一系列的探索研究。

2.1.1 抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活

大量研究表明RA疾病的發(fā)生發(fā)展與多種細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)，如一系列白細(xì)胞介素(IL-3、IL-6、IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和一些干擾素(IFN-γ)等[33-35]。而與JAK激酶家族受體相關(guān)的酪氨酸激酶已被證實(shí)參與RA的過(guò)程，一旦被激活，JAKs便會(huì)募集并激活STATs，當(dāng)STAT被激活后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[36]。在RA中，STAT的激活與滑膜炎癥，滑膜成纖維細(xì)胞(FLSs)的存活都密切相關(guān)[37]。鄧龍飛[38]等發(fā)現(xiàn)灌胃給予威靈仙總皂苷可有效緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的足趾腫脹和體重的減輕，并且可以有效改變滑膜組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)和組織增生。并且分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)了滑膜細(xì)胞中JAK2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3的mRNA水平、磷酸化JAK2(p-JAK2)和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白表達(dá)水平，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示威靈仙總皂苷可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活來(lái)達(dá)到抗炎作用。在細(xì)胞內(nèi)眾多的信號(hào)通路中，磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)對(duì)于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的誘導(dǎo)和放大發(fā)揮著重要作用[39]。Akt作為PI3K的下游，一旦被激活可以發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[40]。已有研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)滑膜增生和TNF-α的分泌[41-42]?；诖耍琖ang等[43]研究了從威靈仙提取的三萜皂苷AR-6對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的干預(yù)作用。病理切片顯示AR-6有效的緩解關(guān)節(jié)炎滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)滑膜組織免疫組化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于模型組AR-6可以減少TNF-α的產(chǎn)生，并且抑制PI3K和磷酸化Akt的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明AR-6發(fā)揮抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活性的機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。相似的，NF-κB作為RA中研究最多的轉(zhuǎn)錄通路，主要調(diào)節(jié)促炎因子的水平和抗凋亡相關(guān)通路[43]，因此也被廣泛的應(yīng)用于治療RA的藥物機(jī)制[44-46]。研究發(fā)現(xiàn)與CIA模型組大鼠相比，AR-6給藥組大鼠的血清中TNF-α、IL-1β水平均有所下降，同時(shí)NF-κB p65的表達(dá)明顯受到抑制。而AR-6處理的大鼠滑膜組織中TNF-α、COX-2和p65的表達(dá)都有所降低。提示AR-6對(duì)于CIA大鼠具有潛在的抗炎作用，并且這種作用機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路受到抑制相關(guān)[47]。

2.1.2 抑制氧化應(yīng)激

細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生可以通過(guò)上調(diào)ROS的釋放進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激，反過(guò)來(lái)又可以再調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 因此細(xì)胞內(nèi)異常的氧化還原狀態(tài)將會(huì)誘發(fā)促炎因子的產(chǎn)生[48-49]。有研究報(bào)道在TNF-α刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，從東北鐵線(xiàn)蓮中提取出的靈仙新苷(C-AR)可以降低TNF-α誘導(dǎo)的 VCAM-1和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了C-AR還可以抑制p65的轉(zhuǎn)位和IκBα的磷酸化水平。此外，C-AR對(duì)TNF-α刺激的細(xì)胞內(nèi)降低的O2和H2O2水平都有回調(diào), 并可以降低NOX4和NADPH氧化酶的活性。但值得一提的是，C-AR并沒(méi)有表現(xiàn)出直接的清除活性氧的能力。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明AR可以通過(guò)調(diào)節(jié)依賴(lài)于NF-κB信號(hào)通路的NADPH氧化酶的活性來(lái)降低VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)[50]。

2.1.3 免疫抑制作用

RA疾病發(fā)生過(guò)程中的另一特點(diǎn)是機(jī)體免疫紊亂，因此免疫療法也在逐漸進(jìn)入大眾視線(xiàn)并有望得到較好的臨床效果[51]。在關(guān)節(jié)炎自身免疫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Treg和Th17亞基呈現(xiàn)一種相反的免疫調(diào)節(jié)作用，故調(diào)節(jié)Treg和Th17亞基的平衡對(duì)于治療關(guān)節(jié)炎是非常重要的[52-53]。目前已有研究證明C-AR在小腸部位有較好的膜透過(guò)性，可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入腸粘膜[54]。基于此，Xiong[55]等人推測(cè)C-AR治療RA的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸粘膜免疫系統(tǒng)相關(guān)。利用AA大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-AR的免疫抑制作用主要是通過(guò)上調(diào) PPS 淋巴細(xì)胞中CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)Treg細(xì)胞的百分比，并誘導(dǎo)ConA-來(lái)激活PPs淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抑炎的細(xì)胞因子(IL-10)，同時(shí)下調(diào)IL-17A和TNF-α的水平；此外，C-AR還具有抑制Th17細(xì)胞表型的活性，從而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞和Th17的比例失衡，最終達(dá)到調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎中的免疫反應(yīng)的作用。

2.1.4 抑制纖維化

除了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有研究提出滑膜組織纖維化也是RA發(fā)病過(guò)程中一個(gè)重要事件，而纖維原細(xì)胞的激活和細(xì)胞外基質(zhì)重塑是纖維化發(fā)生的主要誘因[56-57]。Li[58]等人最近詳細(xì)探討了C-AR抑制RA滑膜組織纖維化的作用機(jī)制，揭示了關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)和纖維化之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，缺氧條件下琥珀酸堆積會(huì)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活，最終加劇CIA大鼠滑膜組織的炎癥反應(yīng)和纖維化。而C-AR可以通過(guò)減輕滑膜缺氧降低琥珀酸的堆積，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活來(lái)達(dá)到抑制炎癥和纖維化的作用。

2.1.5 抑制NO的產(chǎn)生

NO是RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的另一個(gè)促炎因子[59-60]。目前已有研究在RA患者體內(nèi)檢測(cè)到過(guò)高的NO濃度，并證實(shí)了其與RA炎癥反應(yīng)的聯(lián)系[60-61]。Sun等[62]分別利用AA大鼠、腹腔巨噬細(xì)胞和TNF-α刺激的滑膜細(xì)胞考察了AR-6的體內(nèi)體外抗炎活性及機(jī)制。結(jié)果證明AR-6可以抑制體內(nèi)體外IL-1β和IL-6這些促炎因子的分泌。值得一提的是，AR-6對(duì)AA大鼠血清中iNOS水平有抑制作用，并且在腹腔巨噬細(xì)胞和TNF-α刺激的滑膜細(xì)胞中AR-6可以減少 NO的產(chǎn)生。

2.2 抗骨關(guān)節(jié)炎(OA)作用機(jī)制研究

OA是一種慢性的關(guān)節(jié)退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨侵蝕為特點(diǎn)[63]。盡管目前OA的發(fā)病機(jī)理和病因尚不明確，但是可以確定的是炎癥因子引起的軟骨損傷是其發(fā)病的關(guān)鍵原因之一[64-65]。因此，威靈仙三萜皂苷治療OA的作用機(jī)制研究主要圍繞軟骨保護(hù)展開(kāi)。①抑制軟骨破壞相關(guān)酶的表達(dá)：Hsieh等[66]提取了人原代軟骨細(xì)胞，利用LPS刺激后，發(fā)現(xiàn)威靈仙中的丙酮部位的皂苷提取物(CC6)通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)可以發(fā)揮前列腺素E2(PGE2)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制作用，提示CC6可以通過(guò)抑制軟骨破壞相關(guān)酶的表達(dá)來(lái)發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。②抗凋亡和線(xiàn)粒體損傷：Wu等[67]利用硝普鈉刺激兔原代軟骨細(xì)胞釋放NO，并用不同濃度的威靈仙總皂苷提取物處理24h后，檢測(cè)了細(xì)胞的核形態(tài)、細(xì)胞凋亡率、線(xiàn)粒體功能和caspase-3的活性。結(jié)果顯示，威靈仙皂苷提取物可以防止硝普鈉誘發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡。此外，硝普鈉導(dǎo)致的細(xì)胞線(xiàn)粒體膜勢(shì)能的去極化和caspase-3的激活都能被威靈仙皂苷提取物阻斷。基于以上結(jié)果可以推測(cè)，威靈仙皂苷保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的機(jī)制可能與抑制線(xiàn)粒體損傷和激活caspase-3發(fā)揮的抗凋亡作用相關(guān)。③防止細(xì)胞外基質(zhì)降解：Wu等[68]在另外一項(xiàng)研究中通過(guò)給關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射谷氨酸鈉碘乙酸(MIA)建立大鼠骨OA模型，發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷提取物可以抑制MIA引起的軟骨損傷和蛋白聚糖(PG)降解，而陽(yáng)性藥雙氯芬酸僅呈現(xiàn)出微弱的緩解作用。這說(shuō)明威靈仙皂苷提取物可以通過(guò)防止細(xì)胞外基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞損傷起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

3 威靈仙皂苷類(lèi)成分體內(nèi)代謝研究

威靈仙作為傳統(tǒng)中藥，通常以口服用藥為主，進(jìn)入機(jī)體后易受到胃腸道的影響，如酸堿度、腸道菌群及各種酶類(lèi)的影響。威靈仙主要活性成分為總皂苷，當(dāng)其在機(jī)體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化后，生物利用度會(huì)明顯降低。總皂苷進(jìn)入生物系統(tǒng)后，在腸道一系列酶的作用下(包括β葡糖苷酶和酯酶)[69-70]，發(fā)生I相代謝反應(yīng)水解脫去葡萄糖、鼠李糖等糖基，形成不同種類(lèi)的總皂苷代謝產(chǎn)物，故其代謝產(chǎn)物也可能是藥效成分[71]。此前已有文獻(xiàn)表明人參皂苷Rb1的代謝產(chǎn)物Compound K比起原型有更強(qiáng)的生物活性[72-73]。研究威靈仙總皂苷在生物體內(nèi)的藥物代謝變化，揭示原型成分與代謝成分之間的代謝關(guān)系、轉(zhuǎn)化規(guī)律，對(duì)威靈仙的藥效及作用機(jī)制研究將起到重要意義。

4 結(jié) 語(yǔ)

本文首先對(duì)藥典收載的三種基原威靈仙中的三萜皂苷類(lèi)成分的分布進(jìn)行了綜述，一共總結(jié)出56中三萜皂苷類(lèi)成分，其中有45種存在于威靈仙中，17種存在于東北鐵線(xiàn)蓮中，還有7種存在于棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮中。其中，屬于威靈仙特有的三萜皂苷有32種，屬于東北鐵線(xiàn)蓮特有的三萜皂苷有11種。此外，并沒(méi)有找到棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮種特有的三萜皂苷。因此，對(duì)這三種基原威靈仙的三萜皂苷類(lèi)成分進(jìn)行更系統(tǒng)的化學(xué)成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定依然是非常有必要的。

三萜皂苷作為威靈仙發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎活性的主要成分，其具體的作用機(jī)制尚不明確，傳統(tǒng)的研究機(jī)制主要集中于軟骨保護(hù)和抑制細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，近幾年研究發(fā)現(xiàn)的抑制氧化應(yīng)激、抑制纖維化和免疫調(diào)節(jié)等作用機(jī)制為其臨床應(yīng)用提供了新的依據(jù)。此外，針對(duì)威靈仙皂苷的體內(nèi)代謝行為研究發(fā)現(xiàn)其生物利用度極低，進(jìn)而限制了其新藥開(kāi)發(fā)的進(jìn)程。因此，針對(duì)其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究或進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾對(duì)更好的發(fā)揮其藥效具有很大的意義。