徐引弟 ，張青嫻 ，王治方 ，焦文強(qiáng) ，李海利 ，朱文豪 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州450002）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又稱豬地方流行性肺炎（swine enzootic pneumonia），俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病，其是豬呼吸系統(tǒng)的主要病原，在豬呼吸系統(tǒng)綜合征（PRDC）中起著重要作用。MPS發(fā)病的第一階段是豬肺炎支原體通過黏附素p97，p102和p159與呼吸道黏膜纖毛上皮細(xì)胞黏附，此外，豬肺炎支原體還能產(chǎn)生過氧化氫，從而導(dǎo)致相應(yīng)部位的炎癥病變，造成纖毛的停滯、聚集和脫落以及對呼吸道上皮的直接毒性傷害，最終導(dǎo)致細(xì)菌的清除減少，并為繼發(fā)性呼吸道感染打開大門。預(yù)防和控制豬肺炎支原體一般采用優(yōu)化管理方法，如全進(jìn)全出、多點操作、抗菌藥物和疫苗。豬肺炎支原體的無菌狀態(tài)很難維持，特別是在豬密度較高的地區(qū)，因為病菌在空氣中傳播可能長達(dá)幾千米。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物最常用于控制和治療豬肺炎支原體引起的呼吸道疾病，然而，抗生素不能從呼吸道清除豬肺炎支原體，也不能恢復(fù)已經(jīng)發(fā)展的肺部病變；此外，抗生素的大量使用和不合理的使用還會導(dǎo)致抗生素的耐藥性增加，這對動物和人類健康都有重要的不利影響。商業(yè)化疫苗被廣泛應(yīng)用于防治豬支原體肺炎，接種疫苗可以減少臨床癥狀和肺部病變的發(fā)生，但另一方面并不能阻止支原體對呼吸道上皮的定植[1-3]。

本研究從河南省發(fā)生呼吸道疾病的豬場的豬肺中分離鑒定豬肺炎支原體，旨在為河南省豬肺炎支原體的感染情況、流行病學(xué)及綜合防制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料與參考毒株 病料來自于2017年1—12月在河南省大中型豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難的豬的實變的肺臟；陽性對照為豬肺炎支原體168疫苗株，購自南京天邦生物公司。

1.1.2 主要試劑和酶 PPLO肉湯粉、腦心浸出粉、酵母粉購自Difco公司；葡萄糖購自上海國藥集團(tuán)公司；MEM、豬血清購自Hyclone公司；L-精氨酸、酚紅購自Solarbio公司；青霉素，瓊脂粉，2×PCR Mix，DL2000 Marker，Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1.2.1.1 PPLO液體培養(yǎng)基 PPLO肉湯粉21 g，腦心浸出粉16 g，葡萄糖50 g，酵母粉5 g，溶于800 mL超純水中，調(diào)pH值為7.6，定容至1 000 mL，115℃滅菌15 min，配成基礎(chǔ)液；再加入MEM培養(yǎng)基5 mL、豬血清50 mL、青霉素8萬單位、10%精氨酸10 mL和1%（m/V）酚紅500 μL。培養(yǎng)基于115℃滅菌15 min后，于4℃保存?zhèn)溆?。其中，青霉素、精氨酸、酚紅配制為高濃度溶液后過濾除菌，后于-20℃保存。

1.2.1.2 PPLO固體培養(yǎng)基 其是在PPLO液體培養(yǎng)基中加入1.5%（m/V）瓊脂粉。培養(yǎng)基于115℃滅菌15 min后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豬肺炎支原體的分離培養(yǎng) 取適量肉變的病變肺組織加入2 mL的滅菌PBS緩沖液，研磨，取上清，5 000 r/min離心10 min，取上清液0.45 μm濾膜過濾于PPLO液體培養(yǎng)基中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5～7 d后，取1 mL轉(zhuǎn)接PPLO液體培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，傳代3～5代后液體顏色由紅色變?yōu)辄S色，取100 μL涂布PPLO固體培養(yǎng)基表面，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～10 d后，在低倍顯微鏡下逐日觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)。吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 豬肺炎支原體的PCR鑒定

1.2.3.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank中豬肺炎支原體J株（GenBank No.AE017243），7488 株（Genb-ank No.AE017244），232 株 （GenBank No.AE017332），7422株（GenBank No.CP003802）16S rRNA基因序列設(shè)計1對通用引物，用于豬肺炎支原體的擴(kuò)增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列為：上游引物 P1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTG-3′；下游引物 P2：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTAC GA-3′，預(yù)計擴(kuò)增目的片段1 600 bp。

1.2.3.2 豬肺炎支原體的DNA提取 用PBS液將PPLO固體培養(yǎng)基上的菌落洗下，離心、收集菌體，按照DNA提取試劑盒操作說明提取DNA。

1.2.3.3 PCR檢測 PCR體系為 25 μL：2× PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，純水 ddH2O 8.5 μL；待測 DNA2 μL。

PCR 擴(kuò)增程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；最后72℃5 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與純化 將陽性PCR產(chǎn)物回收，16℃連接PMD19-T載體過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含AMP，x-gal，IPTG的LA平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白斑于含AMP的LB中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，PCR檢測，陽性質(zhì)粒由生工生物工程（上海）有限公司測序，序列用Blast軟件進(jìn)行比對分析。

1.2.4 河南省部分豬場豬肺炎支原體的流行情況調(diào)查 2017年1—12月從河南省豬場發(fā)生呼吸困難的豬的實變的肺臟共采集148份，分離鑒定豬肺炎支原體，測序并比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)

肺組織上清傳代后，PPLO固體培養(yǎng)3～5 d后，肉眼可見極小的透明針尖狀菌落；低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)可知，形態(tài)有的為典型的支原體“煎荷包蛋樣”，有的為圓形、隆起的不具備“煎荷包蛋樣”菌落（圖1）。吉姆薩染色，油鏡下觀察支原體菌體形態(tài)可知，其為多形態(tài)，呈球狀、桿狀、螺旋狀、絲狀，大多呈絲狀（圖2）。

2.2 豬肺炎支原體的PCR鑒定

將疑似豬肺炎支原體的肺組織提取DNA，進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出與預(yù)期大小符合的片段（圖3）。陽性片段回收，連接T載體，由測序、比對可知，序列與168株同源性均在95%以上。

2.3 河南省部分豬場豬肺炎支原體的流行情況調(diào)查

2017年1—12月從河南省豬場發(fā)生呼吸困難的豬的實變的肺臟共采集148份樣品，共分離鑒定出25株，分離率達(dá)16.89%。PCR鑒定后測序，與疫苗株168株同源性均在95%以上，與標(biāo)準(zhǔn)株7422株 （GenBank No.CP003802），J株（GenBank No.AE017243），7488 株（GenBank No.AE017244），232株（GenBank No.AE017332）同源性均在98%以上，結(jié)果證實，所分離的均為豬肺炎支原體。表明河南省發(fā)生呼吸道疾病的豬場豬肺炎支原體的陽性率較高。

3 結(jié)論與討論

豬肺炎支原體可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡、品種、性別的豬都易感染。該病一年四季都可發(fā)生，冬季容易多發(fā)。病豬和隱形帶毒豬是主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬比較常見。MPS的診斷方法主要有病原的分離和鑒定、ELISA方法檢測抗體、PCR、原位雜交、芯片檢測等[4-13]。其中，PCR方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。而病原的分離鑒定是檢測病原最為準(zhǔn)確、最有效的方法。

常規(guī)的病原鑒定通常是先分離培養(yǎng)，然后根據(jù)病原在固體或液體培養(yǎng)基上的生長情況、菌落形態(tài)、生理生化特征，進(jìn)而挑菌、染色、鏡檢，最后PCR、測序鑒定，該方法操作復(fù)雜、所需時間長。而對于豬肺炎支原體，由于常規(guī)的PCR檢測操作中，對病變肺組織進(jìn)行研磨后，豬肺炎支原體的含量極少，因此，PCR方法容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，豬肺炎支原體生長條件比較嚴(yán)苛，通常在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d才可以看到培養(yǎng)液顏色的變化，而且必須通過3～5代甚至6～8代的傳代才能富集豬肺炎支原體，從而分離出病原菌，同時，在豬患支原體肺炎時，會同時感染豬鼻支原體和絮狀支原體，后二者很容易掩蓋前者，不利于豬肺炎支原體的檢出。因此，將豬肺炎支原體進(jìn)行培養(yǎng)基擴(kuò)增后與PCR檢測方法相結(jié)合，利用豬肺炎支原體的16S rRNA基因序列設(shè)計出特異性引物，其對于常見的豬鼻支原體、豬敗血支原體、胸膜肺炎放線桿菌、沙門氏菌等其他常見病原菌則不能擴(kuò)出特異片段，以此確保檢測的準(zhǔn)確性及特異性。因此，PCR方法和分離鑒定方法各有優(yōu)缺點，只有PCR檢測方法和分離鑒定方法相結(jié)合，才能準(zhǔn)確地檢測出病原[7-10]。

由于豬肺炎支原體的生長條件苛刻，培養(yǎng)基成分十分復(fù)雜，配制非常繁瑣，培養(yǎng)時間長，因此，選擇合適的培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)，縮短培養(yǎng)時間，是提高分離效率的關(guān)鍵。本試驗選擇了PPLO加酵母粉、腦心浸粉、MEM、葡萄糖、精氨酸、豬血清的培養(yǎng)基，成分相對簡單，配制簡單，但營養(yǎng)高，液體5～7 d能看到顏色明顯變化，固體培養(yǎng)基最早3～5 d就能看見明顯的菌落生長，大大提高了培養(yǎng)效率，縮短了培養(yǎng)時間，提高了分離效率[13-14]。

由于臨床上抗生素的大量使用，使得豬肺炎支原體的耐藥性十分嚴(yán)重，從我們采集的病料來看，大多是使用過大量抗生素治療的，部分是使用過疫苗的，但效果仍然不明顯，或者容易反復(fù)，臨床癥狀和肺部病變?nèi)匀坏湫停糠秩匀荒芊蛛x出豬肺炎支原體。因此，科學(xué)合理使用抗生素和疫苗是防控豬支原體肺炎的關(guān)鍵[15]。

本研究結(jié)合豬肺炎支原體的PCR方法和分離鑒定方法，通過對河南省豬場的患呼吸道疾病的豬進(jìn)行豬肺炎支原體的分離鑒定，分離率高達(dá)16%以上。表明豬肺炎支原體在患呼吸道疾病的豬群中感染率較高，是危害豬場較為普遍、嚴(yán)重的病原。研究結(jié)果可為河南省豬肺炎支原體的病原流行病學(xué)研究、疫苗的研究及綜合防制提供一定的依據(jù)。