祝磊，陳茜，黎江華，彭偉，鐘慈平，余凌英*，吳純潔*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，成都 611137；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，成都 610097)

藤椒來(lái)源于蕓香科花椒屬植物竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的近成熟果實(shí)，為一種特色的藥食兩用之品，具有獨(dú)特的麻香風(fēng)味。竹葉花椒植物在全國(guó)各地分布廣泛，尤以西南地區(qū)種植廣泛，但各地對(duì)其稱謂有所不同，如四川大部分地區(qū)(樂(lè)山、眉山、綿陽(yáng)、雅安、成都等)因其枝葉披散，延長(zhǎng)狀若藤蔓，稱其為藤椒；而四川金陽(yáng)、平昌，云南魯?shù)?、昭通，重慶江津等地則稱其為青花椒[1]。近年來(lái)，藤椒以其獨(dú)特的清香麻鮮味和翠綠的色澤在川菜中掀起一陣鮮麻的風(fēng)潮——藤椒味，促使川菜的“麻”味呈現(xiàn)出嶄新的風(fēng)貌[2]。地方政府也在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、新一輪退耕還林及脫貧攻堅(jiān)、鄉(xiāng)村振興政策實(shí)施過(guò)程中對(duì)藤椒產(chǎn)業(yè)的大力支持，極大地促進(jìn)了川渝地區(qū)藤椒種植業(yè)的迅猛發(fā)展，其種植面積和產(chǎn)量均得以迅速增加[3]。以四川為例，全省花椒栽培面積達(dá)29.33萬(wàn)公頃，其中以竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為代表的藤椒(青花椒)種植面積已達(dá)20.89萬(wàn)公頃，占總栽培面積的71.22%，其產(chǎn)量和面積均為全國(guó)第一，并逐步形成了以四川洪雅、峨眉山、三臺(tái)、金陽(yáng)、平昌等為代表的全國(guó)聞名藤椒(青花椒)基地，洪雅更是被譽(yù)以“中國(guó)藤椒之鄉(xiāng)”的稱號(hào)[4]。

目前，藤椒作為食品主要以鮮藤椒、保鮮藤椒及其加工品(藤椒油)為主，鮮品容易發(fā)生褐變和霉變，為了便于長(zhǎng)期貯存，部分曬干或烘干后作為干藤椒(青花椒)使用。藤椒以其“麻、香”為主要的風(fēng)味特征，且風(fēng)味物質(zhì)也是其主要的活性成分[5]。現(xiàn)有研究報(bào)道藤椒商品中香味物質(zhì)主要為烯類、醇類、酮類、醛類、酯類等揮發(fā)性成分，并具有抑菌、殺蟲(chóng)、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[6-10]；而麻味物質(zhì)主要是一類鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類物質(zhì)，以山椒素類為代表成分(如羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素等)，具有強(qiáng)烈的麻刺感[11,12]，并具有麻醉、鎮(zhèn)痛、驅(qū)蟲(chóng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、保護(hù)胃腸道等生物活性[13-16]。藤椒的開(kāi)發(fā)利用已成為目前研究的重點(diǎn)，但主要集中在藤椒種植及其加工品藤椒油上，而對(duì)其品質(zhì)仍未見(jiàn)有統(tǒng)一的客觀化指標(biāo)，以感官評(píng)價(jià)為主[17,18]，且對(duì)不同藤椒商品風(fēng)味成分的對(duì)比分析研究較少。因此，本文采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技術(shù)分別對(duì)不同藤椒商品(含鮮藤椒、保鮮藤椒、干藤椒及褐變藤椒)的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，以期為藤椒商品的生產(chǎn)加工、開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

鮮藤椒、保鮮藤椒、干藤椒、褐變藤椒皆由四川洪雅茂源藤椒種植場(chǎng)提供，藤椒種子由鮮藤椒于40 ℃下干燥與果皮分離獲得。

羥基-α-山椒素對(duì)照品、羥基-β-山椒素對(duì)照品(自制，純度均大于98%)；分析純甲醇：成都科龍?jiān)噭S；色譜純甲醇、色譜純乙腈：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

島津GC-MS-TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC-MS Solution色譜工作站軟件、Aoc-6000頂空進(jìn)樣器、島津LC-2010A高效液相色譜儀(含SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、LC Solution色譜工作站軟件) 日本島津公司；HP-1510氣相色譜頂空加熱器 上海濟(jì)成分析儀器有限公司；固相微萃取裝置、萃取頭(100 μm PDMS) 美國(guó)Supelco公司；Sartorius BP211D電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；HX-200型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；Auto Science AS5150A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 成都天宇試驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司；ZDHW調(diào)溫電熱套 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；UPT-11-10T優(yōu)普系列超純水器 成都超純科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 藤椒折干率的計(jì)算

隨機(jī)選取鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒、干藤椒100粒，用電子天平稱量，重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒及干藤椒的折干率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同藤椒商品折干率及揮發(fā)油測(cè)定結(jié)果

2.2 香味物質(zhì)分析

2.2.1 揮發(fā)油含量測(cè)定

稱取20 g干藤椒，其余藤椒樣品按表1折干率計(jì)算結(jié)果稱取相應(yīng)重量的鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒。按照《中國(guó)藥典》2015年版中揮發(fā)油測(cè)定法甲法[19]：將稱量好的樣品分別置于圓底燒瓶中，加入15倍量的水與碎瓷片，振蕩混勻，連接好揮發(fā)油測(cè)定器與冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，用電熱套緩緩加熱至沸騰，并保持微沸提取5 h，停止加熱，冷卻至室溫，讀取藤椒揮發(fā)油體積，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 香味物質(zhì)定性分析[20]

2.2.2.1 樣品的萃取與吸附

隨機(jī)選取鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒、干藤椒各15粒分別裝入萃取瓶中，在50 ℃下萃取30 min，插入活化的萃取頭(230 ℃活化3 min)，樣品提取10 min，最后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(230 ℃)脫附3 min。

2.2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

采用Agilent DB-17MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)氣相色譜柱，初始溫度為50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min程序升溫至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min程序升溫至240 ℃，保持5 min(升溫程序)；載氣為He，壓力為68.1 kPa，分流比為35∶1。進(jìn)樣口和接口溫度為240 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，掃描范圍(m/z)為50～550，采集方式為全掃描模式。

2.2.2.3 定性分析結(jié)果

鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒、干藤椒香味物質(zhì)總離子流圖見(jiàn)圖1。樣品中各未知揮發(fā)性成分的定性由質(zhì)譜儀所帶數(shù)據(jù)包(Wiley Library ver.9、NIST Library ver.14和NIST Library ver. 14s)進(jìn)行計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索與匹配，統(tǒng)計(jì)匹配度大于90的揮發(fā)性成分。揮發(fā)性成分的定量分析采用峰面積歸一化法，GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 鮮藤椒(A)、保鮮藤椒(B)、干藤椒(C)及褐變藤椒(D)香味物質(zhì)總離子流圖

峰號(hào)保留時(shí)間(min)化合物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)鮮藤椒保鮮藤椒干藤椒褐變藤椒18.8553-側(cè)柏烯0.110.20.190.1929.160α-蒎烯0.720.91.170.99311.053檜烯10.8616.1313.7415.7411.202β-蒎烯0.60.760.630.82511.454β-月桂烯1.773.684.323.48612.250α-水芹烯0.250.370.750.36712.664α-萜品烯-0.10.14-813.035檸檬烯21.2728.8630.131.48913.398β-水芹烯2.913.875.893.88

續(xù) 表

注：“-”表示未檢出。

2.3 麻味物質(zhì)分析

2.3.1 色譜條件

CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；MGII)，流動(dòng)相：乙腈-水(40∶60)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量5 μL。羥基-α-山椒素對(duì)照品、羥基-β-山椒素對(duì)照品、藤椒及種子的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 羥基-α-山椒素對(duì)照品(E)、羥基-β-山椒素對(duì)照品(F)、藤椒(G)及種子(H) 的色譜

注：1為羥基-α-山椒素；2為羥基-β-山椒素。

2.3.2 樣品前處理

隨機(jī)選取鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒各30粒分別放入3個(gè)不同研缽中，加入適量甲醇混合研磨，將研磨粉碎后的甲醇溶液與殘?jiān)谷?0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度；隨機(jī)選取藤椒種子和干藤椒各30粒分別放于沖缽中粉碎，將粉碎后的種子粉末與干藤椒粉末分別倒入50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度；超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度線，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 線性關(guān)系考察

分別取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密配制成質(zhì)量濃度分別為羥基-α-山椒素1300 μg/mL、羥基-β-山椒素120 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，精密配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.3.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)3次，分別以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各麻味成分在各自范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程見(jiàn)表3。

表3 回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.3.3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取5 μL干藤椒供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別是羥基-α-山椒素0.56%、羥基-β-山椒素0.27%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一干藤椒供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，4，8，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積的RSD分別是羥基-α-山椒素1.21%、羥基-β-山椒素0.86%，表明提取液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一干藤椒30粒，按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為羥基-α-山椒素0.77%、羥基-β-山椒素0.61%。

2.3.3.5 加樣回收試驗(yàn)

稱取同一干藤椒15粒，按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液于容量瓶中，分別精密加入羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素對(duì)照品溶液適量，再用甲醇定容，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，計(jì)算各成分的平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果表明：羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素平均加樣回收率分別為103.21%，101.12%，RSD值分別為2.41%，1.27%。

2.3.4 含量測(cè)定

取各藤椒樣品30粒，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.3.2項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積。根據(jù)分析與計(jì)算，求得羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同藤椒商品麻味物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

注：“—”表示未檢出。

3 討論與結(jié)論

鮮藤椒色澤鮮綠，香麻味濃，采摘及運(yùn)輸時(shí)果皮表面油胞的破裂、干燥貯存的不及時(shí)易造成嚴(yán)重的褐變，且油胞的破裂會(huì)引起油胞中揮發(fā)油以及麻味物質(zhì)的溢出，造成藤椒“色、香、味”品質(zhì)的全面下降，使藤椒的經(jīng)濟(jì)價(jià)值直線下跌。目前研究表明藤椒褐變機(jī)理可能是葉綠素通過(guò)酶降解途徑造成多酚類物質(zhì)的氧化生成黑色素及葉綠素降解生成脫鎂葉綠素等有關(guān)[21]。為了保持鮮藤椒的色、香、味、品質(zhì)，常通過(guò)曬干或恒溫干燥制作成干藤椒保存，或是通過(guò)高溫“殺青”將相關(guān)酶滅活，真空包裝制成保鮮藤椒冷凍保存。本文對(duì)鮮藤椒及其變質(zhì)品褐變藤椒、加工品干藤椒、保鮮藤椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析，探索其質(zhì)量差異。

采用揮發(fā)油測(cè)定法測(cè)定各藤椒商品的香味物質(zhì)總含量，由表1可知，經(jīng)統(tǒng)一折算為相同粒數(shù)的藤椒，鮮藤椒揮發(fā)油量最高達(dá)到2.15 mL，而在鮮藤椒處理不當(dāng)發(fā)生褐變時(shí)其揮發(fā)油含量顯著下降至0.90 mL，而保鮮藤椒、干藤椒的揮發(fā)油含量分別下降至1.80，1.55 mL，這可能是鮮藤椒香味最為濃烈的原因之一；再采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)直接分析不同藤椒商品的香味成分，此方法具有簡(jiǎn)便、快速、高效并能最大保持藤椒原有香味成分的特點(diǎn)[22,23]，共分離鑒定出42種化合物，主要為烯烴類、醇類化合物。由表2可知，各藤椒商品主要成分基本一致，主要為芳樟醇、檸檬烯、檜烯、β-水芹烯等，占總香味成分的80%以上，其中以芳樟醇含量最高。鮮藤椒香味物質(zhì)最為豐富，達(dá)35種，保鮮藤椒香味物質(zhì)相對(duì)最少，只有32種，可能是在漂燙以及冷凍過(guò)程中部分物質(zhì)有所損失造成，損失成分有側(cè)柏酮、4-萜烯醇、β-欖香烯。鮮藤椒獨(dú)有成分為胡椒酮和δ-杜松烯，以新鮮保存方式的鮮藤椒和保鮮藤椒的共同特有成分為草蒿腦、桃金娘烯醛，這可能是新鮮藤椒與干藤椒香氣有所差異的原因之一。鮮藤椒在褐變過(guò)程中產(chǎn)生了氧化芳樟醇、氧化石竹烯、乙酸香葉酯、薄荷腦、傘花烴等產(chǎn)物，并在此過(guò)程中損失了β-羅勒烯、4-萜品烯乙酸酯、γ-杜松烯，這可能是褐變藤椒與鮮藤椒香味差異較大的原因之一。

采用HPLC法測(cè)定不同藤椒商品的麻味物質(zhì)，因鮮藤椒、保鮮藤椒及褐變藤椒均含有藤椒種子，為避免藤椒種子中麻味物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，因此同時(shí)測(cè)定了其藤椒種子中的麻味物質(zhì)。由圖2和表4可知，藤椒種子中并無(wú)麻味物質(zhì)。含量測(cè)定結(jié)果表明，鮮藤椒麻味物質(zhì)含量最高，總量達(dá)到63.55 mg，褐變藤椒最低，總量?jī)H有15.22 mg，不及鮮藤椒麻味物質(zhì)總量的1/4，而保鮮藤椒和干藤椒相對(duì)來(lái)說(shuō)麻味物質(zhì)含量損失較少，分別為52.71，45.93 mg。不同藤椒商品中都含有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素，其中以羥基-α-山椒素含量最高，其含量是羥基-β-山椒素含量的15倍以上。

綜上可以看出，無(wú)論是在麻味物質(zhì)分析還是在香味物質(zhì)分析中，均為鮮藤椒風(fēng)味最佳，保鮮藤椒次之，干藤椒再次之，褐變藤椒最差。本研究分析了鮮藤椒、保鮮藤椒、褐變藤椒及干藤椒的香味物質(zhì)和麻味物質(zhì)，可為不同藤椒商品的“香、麻”評(píng)價(jià)提供一個(gè)客觀參考，同時(shí)也為藤椒的生產(chǎn)加工、開(kāi)發(fā)利用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了借鑒，并為四川花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了理論依據(jù)。