吳 澎 劉 娟 陳廣鳳 趙子彤楊 藝 李向陽 唐曉珍 田紀春

(山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室；山東農業(yè)大學食品學院1，泰安 271018)(德州學院生態(tài)與景觀學院2，德州 253023)(山東農業(yè)大學小麥品質育種研究室；山東省作物生物學重點實驗室3，泰安 271018)

饅頭是我國北方人民的主要面制食品，其消費量占全國面制品消費量的一半，在人們膳食結構中占有非常重要的地位[1]。饅頭的質構與色澤性狀作為影響?zhàn)z頭品質的兩個非常重要的因素，一直被看做評價饅頭質量好壞的指標。目前，國內雖已有許多有關饅頭質構性狀與色澤性狀的研究[2-5]，但相較于國外學者對面包品質從遺傳機理到加工過程都進行大量深入細致的系統(tǒng)研究，并應用到栽培及加工實踐的現(xiàn)狀，國內學者對饅頭的研究深度較小，且多數(shù)局限于原料、配料和工藝條件對饅頭品質的影響[6-10]，對饅頭品質遺傳機理方面的研究幾乎是空白。隨著近幾年分子標記在小麥等植物育種中的1成功運用[11-16]，從分子角度對影響?zhàn)z頭各性狀的基因進行分析成為研究熱點。

全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)是近年來在植物育種中應用比較廣泛的分析技術，它是基于連鎖不平衡原理對目標性狀與遺傳標記或候選基因進行分析，從而準確定位與目標性狀相關的基因位點[17-18]。與基因重組分析方法比較，關聯(lián)分析具有高通量、檢測速度快、精度高的特點，已經(jīng)成功應用于玉米[20]、水稻[21]、擬南芥[22]、油菜[23]、大麥[24]等重要作物。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標記作為新型的第三代分子標記，與傳統(tǒng)分子標記相比SNP具有數(shù)量多、分布廣和密度高的特點，能在待測基因的附近和內部提供一系列標記，可極大的提高關聯(lián)分析的統(tǒng)計效力[25-26]。本實驗通過全基因組關聯(lián)分析對影響?zhàn)z頭質構與色澤性狀的基因位點進行研究，旨在從分子層面比較饅頭感官性狀間的差別，為下一步結合小麥分子育種篩選優(yōu)良饅頭小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及表型鑒定

實驗群體由來自不同國家和省份的205份小麥品種構成，包括55個骨干親本和73個高代品系。其中203份來自于我國種植冬小麥的10個省份，2份分別來自于法國跟墨西哥(見表1)。

表1 供試小麥材料

在2014年和2015年間，分別將供試小麥種植于山東德州實驗點(德州市農業(yè)科學院)和山東泰安實驗點(山東農業(yè)大學)，每份小麥品種播種3行，行長2 m，行與行之間間隔25 cm，重復2次。小麥生長期間，對試驗田進行常規(guī)管理，沒有出現(xiàn)嚴重的病蟲害和倒伏現(xiàn)象。待小麥成熟后，將其收割、編號，研磨成面粉，并按傳統(tǒng)方法制作成饅頭。

待饅頭冷卻后，平放于桌面上，取每個饅頭外表皮的表面頂端為外表面色澤測量點，選取的外表面測量點要求平整光滑，以確保所測結果的準確性。用色差儀測量其L*、a*、b*值，重復3次。測量結束后，用切割機將饅頭平行切割成三片，取中間片的內瓤中間位置作為內表面測量點，測量其L*、a*、b*值，重復3次。測量結束后，取饅頭中間片置于質構儀上，在TPA模式下采用P35探頭進行壓縮實驗[27]，測試前速率3.00 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后速率1.0 mm/s，下壓程度50%。第一次壓縮結束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進行第二次壓縮。采用SPSS18.0軟件對表型數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 DNA提取和90 K SNP 芯片分型

依照稍作修改的Triticarte方法從小麥幼葉中提取DNA，并用0.8%的瓊脂糖電泳對提取DNA的濃度與質量進行檢測。委托加利弗尼亞大學生物技術檢測中心，利用最新開發(fā)的90K SNP基因芯片對群體DNA進行分型，通過GenomeStudio軟件讀取分型結果并保存。同時，為確保獲得的基因數(shù)據(jù)的質量，用PLINK v1.07[28]對基因數(shù)據(jù)進行處理，去除檢出率小于0.8和低頻基因頻率小于0.05的標記，最終得到24 355個標記用于饅頭色澤和質構關聯(lián)分析。

1.3 性狀和標記關聯(lián)分析

運用TASSEL 3.0 軟件中的MLM模型分別對目標性狀(色澤、質構)與標記之間進行關聯(lián)分析。結果中關聯(lián)標記的P<0.001時，表明該標記與目標性狀存在顯著關聯(lián)；P<0.000 1時，表明該標記與目標性狀存在極顯著關聯(lián)。當標記在2個及以上環(huán)境中同時被檢測到則認為其是目標性狀相對穩(wěn)定的關聯(lián)位點。

2 結果與分析

2.1 色澤與質構性狀表型變異比較分析

饅頭色澤的6個相關性狀與質構的7個相關性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)分別如表2和表3所示。四個環(huán)境中，各性狀的變異系數(shù)表現(xiàn)不同，色澤相關性狀中E1環(huán)境內表面a*值變異系數(shù)最大(71.73%)，E4環(huán)境外表面L*變異系數(shù)最小(3.70%)；而質構相關性狀中E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大(58.50%)，彈性變異系數(shù)最小(3.21%)。并且，色澤與質構相關性狀的峰度與偏度絕對值大部分都小于1，基本符合正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀遺傳，適合進行關聯(lián)分析。

表2 四個環(huán)境下饅頭色澤相關性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)

注： E1：2014年泰安點；E2：2014年德州點；E3：2015年泰安點；E4：2015年德州點；內L*：內色差L*值；內a*：內色差a*值；內b*：內色差b*值；外L*：外色差L*值；外a*：外色差a*值；外b*：外色差b*值。

表3 四個環(huán)境下饅頭質構相關性狀在群體中的表型數(shù)據(jù)

注：E1：2014年泰安點；E2：2014年德州點；E3：2015年泰安點；E4：2015年德州點。

2.2 色澤性狀的關聯(lián)分析

通過對性狀與標記的關聯(lián)分析，在P<0.001水平(顯著水平)上，4個環(huán)境中共檢測到276個饅頭色澤性狀關聯(lián)位點，其中23個極顯著(P<0.000 1)關聯(lián)位點，9個相對穩(wěn)定(至少在2個環(huán)境中同時被檢測到)關聯(lián)位點，30個高遺傳貢獻率位點(R2>10%)，分布于小麥21條染色體中的13條(1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A 和7D)，單個位點表型變異貢獻率為7.00%～14.07%。位于7A染色體上的極顯著位點Kukri_c18677_823表現(xiàn)出最大的表型變異貢獻率，可解釋14.07%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測到(見表4)。

表4 4個環(huán)境中與饅頭色澤相關性狀極顯著 (P<0.000 1)、高貢獻率和穩(wěn)定位點

2.3 質構性狀多效性關聯(lián)位點

在與饅頭質構性狀顯著關聯(lián)的位點中(P<0.001)，同時與2個及2個以上性狀存在關聯(lián)的位點被稱為多效性關聯(lián)位點(表5)。23個控制饅頭質構相關性狀多效性關聯(lián)位點及貢獻率見表5。其中，染色體2D上位點Kukri_c13329_800和7A染色體上位點wsnpcEx_c14654_22713386與咀嚼性、黏聚性、硬度、回復性4個性狀同時關聯(lián)，染色體2B上位點Tdurum_contig14707_251與咀嚼性、硬度、膠著性3個性狀同時關聯(lián)，與3個性狀同時關聯(lián)的還有染色體4B上位點Tdurum_contig4974_355和染色體7D上位點D_contig06359contig118，其余18個位點分別同時控制質構相關性狀的2個性狀。

3 討論

饅頭的色澤與質構性狀是衡量饅頭品質優(yōu)良的重要指標之一，不同的小麥品種及環(huán)境都會對成品的表型有一定的影響。本研究得到6個色澤相關性狀，7個質構相關性狀在4個不同環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表明各性狀均表現(xiàn)出不同的變異系數(shù)，外表面a*值、內表面a*值、硬度、黏著性、膠著感和咀嚼性6個性狀的遺傳變異系數(shù)大于20%，表明其遺傳變異豐富，相較于其余性狀，這6個性狀具有較大的改良潛力。遺傳變異系數(shù)處于10%～20%之間的性狀有外表面b*、內表面b*、回復性3個性狀。本實驗群體在以上性狀具有比較豐富的遺傳變異，表明利用冬小麥資源對饅頭色澤、質構性狀改良具有較大的潛力。

本研究利用24 355個SNP位點以及MLM模型對饅頭質構與色澤性狀進行關聯(lián)分析，在顯著水平下檢測到較多的關聯(lián)位點。一方面說明了檢測位點較為全面，另一方面也表明了該實驗群體的遺傳變異較為豐富。環(huán)境因素對作物基因的表達有重要的影響，關聯(lián)位點的表達分為兩類，一類為環(huán)境間特異性表達，另一類為多種環(huán)境下穩(wěn)定表達。本實驗設置4個不同環(huán)境E1、E2、E3、E4，并將在兩個及以上環(huán)境中表達的關聯(lián)位點定義為相對穩(wěn)定的關聯(lián)位點。通常，關聯(lián)分析結果中顯著性較大的位點與性狀的關聯(lián)度較高，假陽性的概率低，因此，本實驗將顯著性較大的位點(P<0.000 1)定義為極顯著關聯(lián)位點。相對穩(wěn)定關聯(lián)位點與極顯著關聯(lián)位點都對研究饅頭質構性狀有較大的意義，因為基因位點的研究目的是將所得性狀位點信息最終應用于分子輔助育種上。

表5 饅頭質構多效性關聯(lián)位點

4 結論

利用分布于小麥全基因組的24 355個SNP位點對205份不同小麥粉饅頭的色澤和質構性狀進行全基因組關聯(lián)分析。檢測到276個饅頭色澤性狀顯著關聯(lián)位點，其中23個極顯著(P<0.000 1)關聯(lián)位點，9個相對穩(wěn)定關聯(lián)位點，30個高遺傳貢獻率位點(R2>10%)，分布于小麥的13條染色體。檢測到23個與饅頭質構性狀存在顯著關聯(lián)的多效性位點，分布于小麥的15條染色體。這些關聯(lián)位點與多效性位點的獲得，有助于從分子層面理解饅頭感官性狀間的差別，并可進一步結合分子育種技術改良饅頭用小麥品種。