趙光遠(yuǎn) 李強 靖彩霞 魏穎軒 張鴻沛

【摘?要】?目的：采用高效液相色譜法對民族藥材大菟絲子中綠原酸含量進(jìn)行測定并開展方法學(xué)研究;方法：以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）為流動相，等度洗脫，流速1.0mL/min，檢測波長327nm，采用C18色譜柱，柱溫30℃，外標(biāo)法定量。結(jié)果：綠原酸在0.5275～105.5μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9994），平均回收率為99.2%（RSD=0.5%）。結(jié)論：測定方法快速、簡便，符合方法驗證要求，可用于大菟絲子中綠原酸含量的測定和質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】?大菟絲子;高效液相色譜法（HPLC）;綠原酸;含量

【中圖分類號】R284.1?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）22-0043-03

Determination?of?Chlorogenic?Acid?in?Ethnic?Medicines?Cuscuta?Japonica?Choisy

ZHAO?Guangyuan?LI?Qiang?JING?Caixia?WEI?Yingxuan?ZHANG?Hongpei

BaoTou?Food?and?Drug?Inspection?&?Testing?Center，?Baotou?014060，?China

Abstract：Objective?Establish?a?method?for?determination?of?chlorogenic?acid?in?Cuscuta?Japonica?Choisy?with?HPLC.?Methods?The?mobile?phase?was?consisted?of?acetonitrile-0.05%?phosphoric?acid?aqueous?solution?（10∶90），?The?flow?rate?was?1.0?mL/?min，?the?detective?wavelength?was?327?nm?and?the?C18?column?temperature?was?30℃.With?external?standard?method?to?make?quantitative?analysis.Results?The?linear?range?of?the?method?was?0.5275?～105.5μg/mL，?the?average?recovery?was?99.2%，RSD?was?0.5%.?Conclusion?This?method?is?simple，?fast?and?efficient，?which?will?be?used?to?provide?accurate，?scientific?quality?control?for?determination?of?chlorogenic?acid?in?Cuscuta?Japonica?Choisy.

Keywords：Cuscuta?Japonica?Choisy;?HPLC;?Chlorogenic?acid;?Content?Determination

大菟絲子Cuscuta?japonica?Choisy.又名日本菟絲子，為旋花科菟絲子屬植物金燈藤的干燥成熟種子。秋季果實成熟時采收植株，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，即可，為少數(shù)民族藥材，不得代替菟絲子，藥用時應(yīng)分別入藥[1]?！秲?nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1988年版）和《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）均收載該品種，大菟絲子性辛、甘、平，具有補肝腎、益精髓、明目的作用，可用于腰膝酸痛、遺精、消渴、目暗、尿頻、淋瀝。《內(nèi)蒙古中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中收錄大菟絲子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅制定了[性狀]和[檢查]項[1]，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收錄的大菟絲子也缺少指標(biāo)成分作為含量控制項目[2]，根據(jù)文獻(xiàn)報道[3-4]，大菟絲子含黃酮類化合物、甾類化合物和有機酸等，有機酸主要含有咖啡酸和綠原酸，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。瞿燕等[4]利用HPLC?法建立了大菟絲子生品和炮制品的特征圖譜，探討大菟絲子炮制前后化學(xué)成分的變化規(guī)律，并未對大菟絲子中綠原酸含量測定方法做系統(tǒng)性研究。馮華等[5]對黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸含量進(jìn)行了測定，樣本收集僅限于貴州地區(qū)，而大菟絲子分布于我國南北各省，越南、朝鮮、日本也有[6]。本實驗采用高效液相色譜法對國內(nèi)不同產(chǎn)地及韓國、朝鮮的9批次大菟絲子中的綠原酸含量進(jìn)行測定，考察不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸的含量差異，為提高和完善大菟絲子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1?儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，PDA檢測器;島津UV-2450紫外分光光度計;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器。

綠原酸對照品（批號：110753-201716;中國食品藥品檢定研究院）;大菟絲子為包頭市食品藥品檢驗檢測中心收集制備并確定基源。乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件與系統(tǒng)適用性?采用SHIMADZU??VP-ODS色譜柱（150mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）為流動相進(jìn)行流動相條件摸索，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。綠原酸峰的理論塔板數(shù)均大于7000，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

2.2?溶液配制

2.2.1?對照品溶液的配制?精密稱取綠原酸對照品10.55mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液10mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為21.10μg/mL的對照品溶液。

2.2.2?供試品溶液的制備?取大菟絲子粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇水混合溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3?采集波長的確定?取對照品溶液置于紫外分光光度計上，在210～350?nm波長范圍掃描。結(jié)果表明綠原酸在327?nm的波長處有最大吸收，故選擇327?nm作為其含量測定的檢測波長，后續(xù)方法學(xué)考察結(jié)果也表明在該波長下測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。典型色譜圖如圖1和圖?2所示。

2.4?線性關(guān)系考察?準(zhǔn)確稱取綠原酸對照品10.55mg，置50mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液（211.0μg/mL），分別精密量取儲備液0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、1mL、1mL、2mL、2.5mL置200mL、100mL、100mL、50mL、10mL、5mL、5mL、5mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到系列濃度見表2，分別測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，回歸方程為：y?=34310x-38873?（x為濃度，y為峰面積）?r=0.9994。綠原酸在0.5～105μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

2.5?精密度試驗?精密吸取綠原酸對照品溶液（濃度為21.10μg/mL）10μL，注入高效液相色譜儀，?按“2.1”?項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，?記錄綠原酸圖譜，?綠原酸平均峰面積值為655031，RSD為0.3%。表明方法的精密度良好。

2.6?穩(wěn)定性考察?取同一份供試品溶液，過濾后室溫放置，分別在0?h、2?h、4?h、8?h、12?h、24?h后按2.1中的色譜條件進(jìn)行測定，試驗結(jié)果見表3，放置不同時間的峰面積RSD為0.2%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7?重復(fù)性試驗?稱取同一供試品6份，分別照2.2.2處理并測定綠原酸含量，6份供試品綠原酸平均含量為0.1772%，RSD為0.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8?加樣回收率試驗?取已測定含量（含量0.1772%）?的同一供試品6份，每份約0.25?g，精密稱定，分別置6個具塞錐形瓶中，各精密加入濃度為180.0μg/mL的綠原酸對照品溶液各2.50mL及50%甲醇溶液47.5mL，按2.2.2中供試品處理方法進(jìn)行處理并測定含量，結(jié)果見表4，綠原酸的平均回收率（n=6）為99.2%，RSD=0.5%，表明該方法回收率良好。

3?樣品含量測定

取9批材大菟絲子，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1方法測定綠原酸含量（以干基計）。結(jié)果見表5。

4?討論

選用甲醇和水溶混合溶劑劑提取，分別考察15?min、30?min、45?min不同超聲提取時間對提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取30min，綠原酸已經(jīng)基本提取完全;在提取過程中，改變甲醇-水比例（25%、50%、75%）進(jìn)行提取溶劑比例的考察，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇的提取效果較為理想。

通過對9個不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸含量測定發(fā)現(xiàn)：綠原酸含量最高的為0.7789%（7號樣，河南），含量最低的為0.1786%（4號樣，云南），不同產(chǎn)地的大菟絲子中綠原酸的含量差異明顯，相差4倍多，制定相應(yīng)質(zhì)量指標(biāo)限度時需要進(jìn)一步考察多產(chǎn)地藥材數(shù)據(jù)結(jié)果。中藥材中綠原酸含量測定方法中多以磷酸調(diào)節(jié)流動相酸度[7]，在方法制定及9批大菟絲子中綠原酸含量測定實驗過程中發(fā)現(xiàn)，使用磷酸調(diào)節(jié)流動相酸度時，濃度不宜過高，流動相pH值過低容易造成色譜柱固定相的水解流失，引起柱效下降甚至損壞[8]，在滿足要求的前提下盡量降低使用濃度，因此，本方法流動相采用的磷酸溶液濃度為0.05%，其pH值為2.2，滿足實驗要求的同時也不會對色譜柱造成損壞。

綜上結(jié)果表明本法可靠，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，對色譜柱破壞小，可作為大菟絲子中綠原酸含量的分析方法，同時9批大兔絲子中綠原酸含量的測定結(jié)果也為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中指標(biāo)成分的限度制定提供參考數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[6]歐恒熙.大菟絲子炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].貴陽：貴陽醫(yī)學(xué)院，2013.

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（收稿日期：2019-09-10?編輯：劉?斌）