胡素珍黎宛妍敖然張大鵬張志敏

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州510030)

五味子乙素(Schisandrin B，Sch B)是中藥五味子[Schisandra chinesis(Turcz.)Baill]木脂素類主要活性成分之一。多種研究表明，Sch B具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗心肌缺血、保肝利膽等生物活性[1，2]。慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以進(jìn)行性、不完全可逆性氣流受限和肺部炎性病變?yōu)橹饕卣鞯穆苑尾考膊?，具有反?fù)發(fā)作、進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)。其發(fā)病機(jī)制雖未完全清楚，但與煙霧或有害氣體和顆粒引起的肺部或全身的炎癥反應(yīng)有關(guān)，炎癥反應(yīng)過程進(jìn)一步可引起COPD急性發(fā)作(Acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD )，因此控制和減輕AECOPD 患者局部或全身的炎癥反應(yīng)對(duì)提高療效具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細(xì)胞A549為研究對(duì)象，在體外成功建立了CSE聯(lián)合LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞COPD急性加重期模型，以A549細(xì)胞相關(guān)增殖抑制、mRNA水平、蛋白水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步探討Sch B對(duì)CSE聯(lián)合LPS對(duì)A549細(xì)胞炎癥損傷及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 肺上皮細(xì)胞A549由廣州醫(yī)科大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2藥物及試劑 五味子乙素購自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、0.25 mg/ml 胰蛋白酶(美國Gibco)；青-鏈霉素雙抗(×100)、PBS(×1)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma)；RT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；NF-κB Pathway sampler Kit、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；IL-8、COX-2 ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.1.3儀器及耗材 CO2培養(yǎng)箱( Thermo，311 型，美國)； 超凈工作臺(tái)( ESCO，新加坡)；熒光定量PCR儀( 7500，ABI，美國)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22，BECKMAN，R美國)；倒置顯微鏡(IX71，Olympus，日本)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將肺上皮細(xì)胞A549用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，以0.25%胰酶消化，用于傳代或種板。

1.2.2體外制備COPD急性加重期細(xì)胞模型(CSE聯(lián)合LPS) 香煙煙霧提取物的制備 香煙為“紅雙喜”牌香煙(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量11 mg；煙堿量1.2 mg；一氧化碳量13 mg)，5 ml無血清的RPMI1640培養(yǎng)基裝入2個(gè)串聯(lián)的氣體采樣管(大包氏管)內(nèi)作為吸收液，點(diǎn)燃去掉過濾嘴的香煙，采集香煙主流煙霧。大包氏管一端連接香煙，另一端連接50 ml注射器，以50 ml/min的速度吸煙2支，每支煙吸10次，然后將該溶液pH值調(diào)整為7.40，并用0.22 μmol/L 濾孔直徑的濾膜過濾，去除細(xì)菌和顆粒，制備成100%CSE溶液[3,4]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋成不同梯度濃度。30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。脂多糖(Lipoplysaccharide,LPS)使用終濃度為0.4 μg/ml。與CSE共同加入肺上皮細(xì)胞中作用 24 h 制備COPD急性加重期體外模型。

1.2.3細(xì)胞分組 細(xì)胞共分為4組，即空白對(duì)照組(CON)、模型組(CSE+LPS)、低劑量Sch B組(5 μmol/L)、高劑量Sch B組(20 μmol/L)[5,6]。當(dāng)細(xì)胞生長至適合造模和給藥時(shí)，CON用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予4% CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS，給藥組除造模外給予相應(yīng)劑量Sch B。收集細(xì)胞或上清，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml，用PBS配制，pH調(diào)整為7.4)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值(OD)并分析存活率，存活率=OD給藥組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.5熒光定量PCR法檢測(cè)相關(guān)因子表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，吸棄上清，用預(yù)冷PBS(×1)溶液洗3次，然后加入1 ml Trizol，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260 nm、A280 nm，計(jì)算RNA樣品的濃度和純度，A260 nm/A280 nm在1.9～2.1之間視為合格。cDNA合成按照Prime ScriptTMRTreagent kit 說明書操作，總RNA取樣2 μg,為有效地反轉(zhuǎn)錄全長mRNA。qPCR反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件為95℃ 30 s 預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，每份樣品做復(fù)孔檢測(cè)。IL-8上游引物CCACCGGAGCACTCCATAAG，下游引物GATGGTTCCTTCCGGTGGTT；COX-2上游引物GTTCCACCCGCAGTACAGA，下游引物AGGGCTTCAGCA-TAAAGCGT；GAPDH上游引物GAAAGCCTGCCGGTGACTAA，下游引物AGGAAAAGCATCACCCGGAG。mRNA相對(duì)表達(dá)量用比較CT值法計(jì)算，以基因GAPDH為內(nèi)參，即用內(nèi)參基因和靶基因CT值差(ΔΔCT)計(jì)算靶基因相對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)量(2-ΔΔCT)，然后與對(duì)照組比較，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組mRNA的相對(duì)表達(dá)量(RNA relative quantity)。

1.2.6ELISA檢測(cè)相關(guān)指標(biāo) 各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，收集細(xì)胞上清，1 000 rcf,4℃,離心15 min取上清進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟：將ELISA試劑盒中各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30 min，按各自試劑配制方法配制試劑以備用；加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μl，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃溫育2 h；棄去液體，甩干，不用洗滌；每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μl/孔，甩干；每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μl/孔，甩干；依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色15～30 min；依序每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)；在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測(cè)量各孔的光密度。

1.2.7免疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)法檢測(cè)磷酸化蛋白水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間后，吸棄細(xì)胞上清，用冰凍PBS(×1)清洗3次，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心20 min,取上清，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，GAPDH,NF-κB，pNF-κB抗體(1∶2 000)孵育4℃過夜，TBST(×1)洗滌，10 min/次，3次，鼠抗兔IgG二抗孵育1 h，TBST(×1)洗滌，10 min/次，3次，化學(xué)顯影，檢測(cè)蛋白表達(dá)。以GAPDH 為內(nèi)參照計(jì)算相對(duì)灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1五味子乙素抑制CSE聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞增殖 首先用1～60 μmol/L Sch B作用肺上皮細(xì)胞A549 48 h，觀察Sch B對(duì)肺上皮細(xì)胞的直接抑制作用。結(jié)果見圖1A。結(jié)果表明，不同濃度的Sch B均對(duì)A549細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性(P<0.05)。其次用4%CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS作用A549細(xì)胞24 h后，制備COPD急性加重期模型，見圖1B。結(jié)果表明，CSE聯(lián)合LPS能夠明顯促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B后，逆轉(zhuǎn)了4% CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS對(duì)細(xì)胞的過度增殖作用，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2五味子乙素抑制CSE聯(lián)合LPS處理肺上皮細(xì)胞IL-8、COX-2 mRNA的表達(dá) 用4% CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS作用A549細(xì)胞24 h后，采用熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞IL-8、COX-2 mRNA水平，見圖2A、B。結(jié)果表明，CSE聯(lián)合LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞中IL-8、COX-2的表達(dá)水平，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 作用72 h后，IL-8、COX-2的mRNA水平明顯降低，特別是20 μmol/L的Sch B作用更加明顯，與模型組比較差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3五味子乙素減少CSE聯(lián)合LPS對(duì)A549細(xì)胞上清IL-8、COX-2的含量 用4% CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS作用A549 細(xì)胞24 h后，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清IL-8、COX-2的含量，見圖3。結(jié)果表明，CSE聯(lián)合LPS能夠增加細(xì)胞上清IL-8、COX-2的含量，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)；分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 48 h后，細(xì)胞上清IL-8的含量均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且成一定的劑量依賴性。分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 48 h后，細(xì)胞上清COX-2的含量均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)。

2.4五味子乙素下調(diào)CSE聯(lián)合LPS對(duì)A549細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白水平 用4% CSE聯(lián)合0.1 μg/ml LPS作用A549細(xì)胞24 h后，用蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白水平，見圖4。結(jié)果表明，CSE聯(lián)合LPS能夠上調(diào)A549細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白水平，與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)； 分別給予5 μmol/L和20 μmol/L Sch B處理48 h后，A549細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白水平明顯下調(diào)，其中以20 μmol/L 的Sch B作用更為明顯。

圖1 Sch B抑制CSE聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞增殖Fig.1 Sch B inhibits proliferation of lung epithelial cells induced by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05,***.P<0.01；compared with model group,#.P<0.01.

圖2 Sch B抑制CSE聯(lián)合LPS處理肺上皮細(xì)胞IL-8(A)、COX-2(B)mRNA的表達(dá)Fig.2 Sch B inhibits expression of IL-8(A) and COX-2(B)mRNA in lung epithelial cells induced by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05,***.P<0.01；compared with model group,#.P<0.05；ns.No statistical difference.

圖3 Sch B減少CSE聯(lián)合LPS對(duì)A549細(xì)胞上清IL-8(A)、COX-2(B)含量Fig.3 Sch B reduces content of IL-8(A) and COX-2(B) in supernatant of A549 cells by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05，***.P<0.01;compared with model group,#.P<0.05.

圖4 Sch B下調(diào)CSE聯(lián)合LPS對(duì)A549細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白水平Fig.4 Sch B down-regulates phosphorylation of NF-κB protein in A549 cells by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

五味子，習(xí)稱“北五味子”，是木蘭科植物五味子的干燥成熟種子，是著名的滋補(bǔ)性中藥，功能收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心；臨床主要應(yīng)用于久咳虛喘；夢(mèng)遺滑精，遺尿尿頻；久瀉不止；自汗，盜汗；津傷口渴，內(nèi)熱消渴；心悸失眠?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子的主要活性成分是木脂素類，而Sch B是五味子木脂素的主要活性成分之一[7，8]。據(jù)報(bào)道，Sch B具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、保肝利膽等作用[9-12]。其中，Sch B抗炎作用已被用于哮喘，支氣管擴(kuò)張，慢性阻塞性肺氣腫等疾病的治療。對(duì)Sch B抗炎作用及機(jī)制的研究，有助于更加合理有效地運(yùn)用Sch B以及開發(fā)五味子的臨床應(yīng)用。

COPD是一種以進(jìn)行性、不完全可逆性氣流受限和肺部炎性病變?yōu)橹饕卣鞯穆苑尾考膊?，具有反?fù)發(fā)作、進(jìn)行性發(fā)展的特點(diǎn)[13]。各種有害氣體和顆粒是誘發(fā)肺部炎性病變的主要原因，可引起COPD急性發(fā)作及加重病情。AECOPD過程中釋放的炎癥介質(zhì)，可導(dǎo)致一系列的生理、病理變化，急性加重期可反復(fù)發(fā)作和漸進(jìn)發(fā)展，導(dǎo)致病情逐步加重，引起呼吸衰竭，甚至危及生命。

AECOPD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前研究認(rèn)為氣道和肺組織對(duì)香煙、煙霧、職業(yè)性粉塵等有害氣體或有害顆粒所引起的異常炎性反應(yīng)具有密切的關(guān)系。研究認(rèn)為，有害氣體或有害顆粒可以通過其毒性損傷、氧化應(yīng)激等方式引發(fā)氣道的異常炎癥反應(yīng)。單香煙而言，其煙霧含有500多種化學(xué)物質(zhì)組成的高毒性復(fù)雜混合物，如尼古丁、一氧化碳、甲醛、乙醛、丙烯醛、苯酚和氰化物等有害成分。香煙煙霧暴露可激活并聚集氣道及肺泡的炎性反應(yīng)細(xì)胞，使其釋放多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)及細(xì)胞因子，破壞氣道和肺的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)，造成氣管狹窄、不完全堵塞，導(dǎo)致COPD的發(fā)生[14]。

LPS是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分之一，可以刺激組織細(xì)胞，進(jìn)而釋放出多種炎癥介質(zhì)(包括細(xì)胞因子和趨化因子等)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，是常用的細(xì)胞炎癥模型的造模工具。已有多項(xiàng)研究采用香煙煙霧提取物聯(lián)合LPS制備COPD急性加重期體外模型[15]，本研究結(jié)果也表明，香煙煙霧提取物聯(lián)合LPS模型組細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞炎癥水平升高，與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CSE聯(lián)合LPS可造成肺上皮細(xì)胞炎癥性損傷，體外損傷模型制備成功。

IL-8和環(huán)氧合酶-2(COX-2)是重要的炎癥介質(zhì)[16，17]，是參與AECOPD炎癥反應(yīng)過程的重要因子，大量文獻(xiàn)報(bào)道研究表明，在AECOPD的炎癥反應(yīng)過程中，IL-8和COX-2水平是上調(diào)的，給予相應(yīng)濃度的藥物后，可以下調(diào)IL-8和COX-2的水平[18，19]，本研究也表明，給予五味子乙素后，能夠下調(diào)IL-8、COX-2的基因和蛋白水平，與其他人的研究結(jié)果相一致。

核因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)，是一類可與免疫球蛋白κB輕鏈基因增強(qiáng)子特異性結(jié)合的核蛋白因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，激活后能夠調(diào)控多種與細(xì)胞生長、生存、凋亡等相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、增殖、凋亡等生理活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在正常組織和癌旁組織中不表達(dá)或者微表達(dá)，并且處于激活和失活的平衡狀態(tài)，從而使細(xì)胞處于生理平衡狀態(tài)，維持正常的生理功能。但在病理情況下，NF-κB往往處于高表達(dá)狀態(tài)。已有研究表明，香煙提取物可以明顯上調(diào)肺上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路[20]，下調(diào)磷酸化NF-κB蛋白水平，可能是COPD急性發(fā)作期的一種治療策略。本實(shí)驗(yàn)提取了肺上皮A549細(xì)胞總蛋白，分別檢測(cè)細(xì)胞中總的以及磷酸化NF-κB的表達(dá)水平。結(jié)果表明CSE聯(lián)合LPS模型組磷酸化NF-κB表達(dá)水平增加，說明NF-κB通路參與了COPD炎癥反應(yīng)過程，通過調(diào)控這條信號(hào)通路，有望在COPD的發(fā)展過程中，減少或抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而改善COPD的炎癥微環(huán)境，降低COPD的發(fā)病[21]。本研究結(jié)果也證實(shí)，給予五味子乙素后，A549細(xì)胞磷酸化NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，表明五味子乙素可能在COPD急性發(fā)作期有一定的治療價(jià)值。

總之，采用CSE聯(lián)合LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞A549炎癥損傷，以此建立COPD急性加重期細(xì)胞模型，并同時(shí)給予五味子乙素干預(yù)。本研究結(jié)果表明五味子乙素能夠抑制CSE聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的過度增殖，抑制模型細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)，顯示具有較好的抗炎作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的IL-8、COX-2等的表達(dá)，從而改善炎癥微環(huán)境有關(guān)。本研究結(jié)果也與其他研究者發(fā)現(xiàn)的五味子乙素具有的抗炎以及抗氧化的結(jié)果相一致[22]。