鄭 璐 孫蕾清 陳復(fù)興 周 燏 呂小婷 陳 玲 李 瑩 周忠海 陳永強(qiáng)

(解放軍第97醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，徐州221004)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條在進(jìn)化中極為保守的通路，在調(diào)控干細(xì)胞的形成、細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等生理過程中起重要作用[1,2]。由于在許多腫瘤中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異?；罨?，許多研究發(fā)現(xiàn)該通路可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)并研發(fā)出一系列Wnt信號(hào)通路抑制劑，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)[3,4]。近年來腫瘤患者自身免疫細(xì)胞及嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞免疫療法成為研究的熱點(diǎn)。Gattinoni等[5]利用Wnt信號(hào)通路激活劑TWS119活化T淋巴細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以獲得一群在體內(nèi)具有較強(qiáng)的增殖和腫瘤殺傷活性的干細(xì)胞樣記憶CD8+T細(xì)胞 (TSCM)，而且還發(fā)現(xiàn)CD19-CAR TSCM體內(nèi)抗腫瘤效果優(yōu)于傳統(tǒng)的CD19-CAR T細(xì)胞[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TWS119還可以調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞的分化、增殖及腫瘤殺傷活性[7,8]。AR-A014418(圖1)也是一種選擇性的GSK3β抑制劑，可以通過抑制GSK3β酶活性活化Wnt信號(hào)通路[9]。因此，本研究想觀察Wnt信號(hào)通路激活劑AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞增殖、凋亡及其腫瘤殺傷活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 AR-A014418購(gòu)自MCE公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解配制成20 mmol/L的母液于-20℃儲(chǔ)存；Annexin V-FITC/7-AAD apoptosis 試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；CFSE購(gòu)自Invitrogen公司；帕米磷酸二鈉購(gòu)自深圳海王藥業(yè)有限公司；RPMI1640和小牛血清購(gòu)自Gibco 公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；熒光抗體APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR購(gòu)自BD公司；Western及IP細(xì)胞裂解液試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-Tublin一抗購(gòu)自Abcam公司；人AB型血清購(gòu)自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 抽取健康人外周抗凝血10 ml，用生理鹽水1∶1稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液，1 800 r/min離心15 min，分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。將分離獲得的PBMCs加入γδT細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清、5%AB血清、3 μmol/L的帕米膦酸二鈉和200 U/ml rhIL-2)中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞用APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR抗體標(biāo)記細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行γδT細(xì)胞鑒定。

1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法檢測(cè)AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等量的DMSO。培養(yǎng)72 h后取每組的細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖1 AR-A014418結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of AR-A014418

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞，用生理鹽水將γδT細(xì)胞配成濃度為1.0×107ml-1的細(xì)胞懸液，加入終濃度為1 μmol/L的CFSE，37℃孵育15 min后加入10倍體積的完全培養(yǎng)基終止染色，離心洗滌2遍后，將CFSE標(biāo)記的γδT細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，然后加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對(duì)照組加入等量的DMSO。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次，每管加入anti-γδTCR-APC 5 μl，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞的增殖情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞凋亡的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對(duì)照組加入等量的DMSO。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次，根據(jù)Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡試劑盒說明書操作步驟，每管分別加入Annexin V-FITC和7-AAD，染色結(jié)束后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞凋亡比例，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞體外殺傷活性 將AR-A014418處理72 h后的γδT細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)與CFSE標(biāo)記的人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞(靶細(xì)胞)按照效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞10∶1和20∶1的比例加入96孔U型孔中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次，每管加入7-AAD 5 μl,室溫避光孵育5 min后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2和SGC-7901細(xì)胞的凋亡情況，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot分析蛋白的表達(dá) γδT細(xì)胞經(jīng)AR-A014418處理72 h后，收集細(xì)胞用Western及IP細(xì)胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法測(cè)樣品蛋白濃度后用12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000) 4℃封閉過夜，二抗(1∶1 000) 37℃孵育1 h。然后用成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1γδT細(xì)胞鑒定 分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用γδT細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后流式細(xì)胞儀鑒定，結(jié)果如圖2A、B顯示，Pan γδT細(xì)胞純度達(dá)到(87.6±4.3)%，Vδ2 T細(xì)胞比例約為(84.6±3.1)%。以上結(jié)果提示γδT 細(xì)胞培養(yǎng)成功，而且以Vδ2 T細(xì)胞為主可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響 CFSE 是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，CFSE 進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。在細(xì)胞分裂增殖過程中，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖3A、 B顯示AR-A014418濃度在0.3～3 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞的增殖，其中3 μmol/L 時(shí)增殖率最大 (P<0.05,P<0.01)，而當(dāng)濃度大于3 μmol/L后γδT細(xì)胞增殖率又降低。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果也同樣顯示AR-A014418在3 μmol/L時(shí)γδT細(xì)胞數(shù)由對(duì)照組的(3.18±0.12)×106個(gè)升高到(4.21±0.26)×106個(gè)(P<0.05,P<0.01)(圖3C)。另外，如圖3D所示AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞亞群的改變沒有明顯變化。

圖2 γδT細(xì)胞鑒定Fig.2 Identification of γδT cells

2.3AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞凋亡的影響 培養(yǎng)10 d后的γδT細(xì)胞再經(jīng)AR-A014418處理72 h后，經(jīng)Annexin V-FITC /7-AAD雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖4A、B所示，對(duì)照組γδT細(xì)胞凋亡率為(25.14±1.94)%，而經(jīng)0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理后，細(xì)胞凋亡率分別為：(21.08±1.37)%、(18.38±2.83)%、(16.01±2.33)%和(22.57±1.89)%。以上結(jié)果表明AR-A014418體外可以抑制γδT細(xì)胞的凋亡(P<0.05,P<0.01)。同時(shí)，經(jīng)0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理72 h后，蛋白水平檢測(cè)顯示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax表達(dá)量逐漸減弱，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量逐漸增強(qiáng)(圖4C)。

2.4AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞殺傷人腫瘤細(xì)胞活性的影響 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3 μmol/L的AR-A014418促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖且抑制其凋亡結(jié)果最顯著。因此我們選擇3 μmol/L的AR-A014418處理72 h 后的γδT細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按照效靶比分別為10∶1和20∶1進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖5A、B所示，與對(duì)照組相比，3 μmol/L AR-A014418處理后的γδT細(xì)胞對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞殺傷效率 (18.01±2.04)% vs (33.8±3.41)%和(36.03±2.76)% vs (57.82±4.15)%顯著提高(P<0.01)；對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞殺傷效率 (27.30±1.70)% vs (42.43±3.93)% 和(46.82±4.61)% vs (71.67±5.27)%顯著提高(P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果顯示AR-A014418可以增強(qiáng)γδT細(xì)胞的體外殺傷腫瘤活性。

圖3 AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of AR-A014418 on growth of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 AR-A014418對(duì)γδT細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of AR-A014418 on apoptosis of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖5 AR-A014418處理后的γδT細(xì)胞對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷效應(yīng)Fig.5 Killing activities of γδT cells treated with AR-A014418 against HepG2 and SGC-7901 cells

3 討論

γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中表達(dá)γδTCR的一個(gè)亞群，是近年來研究較多的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，主要以MHC非限制性方式識(shí)別腫瘤抗原從而發(fā)揮殺傷作用[10]。目前體外常規(guī)擴(kuò)增的γδT細(xì)胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效[11,12]。為了提高γδT細(xì)胞治療腫瘤效果，目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中于通過多種細(xì)胞因子和藥物等進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT細(xì)胞及條件優(yōu)化，來提高γδT細(xì)胞的體外增殖倍數(shù)及殺傷功能[8,13-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AR-A014418在0.3～3 μmol/L濃度范圍時(shí)不僅能促進(jìn)體外γδT細(xì)胞的增殖，而且還能抑制其凋亡，尤其在3 μmol/L效果最為顯著。另外在3 μmol/L時(shí)AR-A014418還能增強(qiáng)γδT細(xì)胞的體外殺傷人肝癌HepG2細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞活性。提示AR-A014418可以提高體外培養(yǎng)γδT細(xì)胞的數(shù)量和功能，為今后體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞用于腫瘤患者細(xì)胞免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)激酶，是藥物篩選的重要靶點(diǎn)。目前針對(duì)該靶點(diǎn)的靶向藥物L(fēng)ithium和Valproic acid已獲批分別用于治療抑郁癥和癲癇?。籉lavopiridol 和Staurosporine 用于晚期實(shí)體瘤和血液病的治療已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期[17]。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GSK-3β抑制劑TWS119在體外可以增強(qiáng)γδT細(xì)胞的增殖和腫瘤殺傷活性[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β另一抑制劑AR-A014418也具有類似功能，提示我們GSK-3β可能成為今后體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的有效靶點(diǎn)。

綜上所述，GSK-3β抑制劑AR-A014418在3 μmol/L 濃度時(shí)，可以抑制體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的凋亡，并且還能增強(qiáng)其體外增殖和殺傷腫瘤活性。結(jié)合前期研究和上述結(jié)論說明GSK-3β可能成為今后體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的有效靶點(diǎn)，以及GSK-3β抑制劑AR-A014418具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。