朱 靜 楊 鷹

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶400037)

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位，而其致死率卻位列首位[1]。近年來，臨床上卵巢癌的治療雖然在傳統(tǒng)手術(shù)、化療及放療技術(shù)上有所改進(jìn)，但晚期患者的5年生存率仍不容樂觀，其主要原因是由于卵巢癌早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)已至進(jìn)展期，延誤了最佳診治時(shí)機(jī)[2]。因此，尋找新的、有效的卵巢癌分子標(biāo)志物，對(duì)提高卵巢癌早期篩查與診斷具有重要意義。

人 Pin2 結(jié)合蛋白 X1 ( PIN2-interacting protein X1，PinX1)定位于人染色體8p23，是端粒和端粒酶的調(diào)控基因[3]。近年來研究顯示，PinX1是一種潛在的抑癌基因，其表達(dá)水平的改變可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在包括膀胱癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實(shí)體瘤中表達(dá)明顯降低或不表達(dá)[4-7]。過表達(dá)PinX1可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低裸鼠體內(nèi)的成瘤性[8,9]。然而PinX1在卵巢癌細(xì)胞中的研究較少，PinX1 在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中是否發(fā)揮著同樣的重要作用目前尚不清楚。為此，本研究分別在 mRNA 及蛋白水平上檢測(cè)了PinX1 在人卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，并通過構(gòu)建PinX1過表達(dá)重組載體，進(jìn)一步探討過表達(dá)PinX1對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖及遷移的影響，旨在初步闡明PinX1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，為尋找卵巢癌有效的診斷及預(yù)后靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人PinX1單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗人MMP2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OmegaBio-Tek公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞(Caov3、OVCAR3、A2780、SKOV3)及人正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE80由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。

1.2.2PinX1真核過表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 根據(jù)PinX1基因在Genebank中的cDNA序列(NO:NM_017884.5) 設(shè)計(jì)上下游引物，并由上海生工合成，同時(shí)提取卵巢癌細(xì)胞SKOV3 總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并膠回收，按照pCMV-N-Flag操作手冊(cè)構(gòu)建重組載體，酶切鑒定并測(cè)序。

將SKOV3細(xì)胞以 2×105個(gè)/孔接種于 6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90% 融合時(shí)，參照 Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書，分別將pCMV-N-Flag-PinX1和空載體轉(zhuǎn)染至6孔培養(yǎng)板中，4 h后更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組為：vector組(轉(zhuǎn)染空載體)，PinX1組(轉(zhuǎn)染pCMV-N-Flag-PinX1重組載體)。

1.2.3Real-time PCR 按照RNA 提取試劑盒說明書提取已收集的各組細(xì)胞總 RNA。采用SYBR Green 法 進(jìn) 行Real-time PCR，用于擴(kuò)增PinX1 cDNA的上游引物為:5′-GGGTGGTCTAAAGGA-AAGGGTT-3′,下游引物:5′-CGCCCTCGGGAGTCTT-CTTAC-3′;GAPDH上游引物:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引 物:5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′,反應(yīng)條件為:94℃ 2 min預(yù)變性;94℃ 30 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共 35 個(gè)循環(huán)，采用 2-ΔΔCT法計(jì)算并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4Western blot 收集各組細(xì)胞，加入990 μl細(xì)胞裂解液及10 μl PMSF提取細(xì)胞總蛋白，采用BSA 法測(cè)定蛋白濃度，按1∶4加入適量上樣緩沖液于100℃煮沸5 min變性;每孔 40 μg，采用80 V恒壓、10%分離膠 SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，100 V 100 min 恒壓將蛋白印跡電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗( PinX1 1∶1 000、 c-myc 1∶500、MMP2 1∶1 000) 4℃ 孵育過夜，次日 TBST 漂洗 5 min×5次，加入 HRP 標(biāo)記的二抗(1∶3 000) 室溫孵育40 h，TBST 漂洗5 min×5次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，使用 Quantity One 軟件分析并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 以2×103個(gè)/孔將已轉(zhuǎn)染24 h 的細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后記為 0 h，分別在 24、48、72、96 h 時(shí)間點(diǎn)，加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育1.5 h，檢測(cè) 450 nm 處光密度值。

1.2.6Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell 小室上室加入60 μl Matrigel，下室中加入含15%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，收集已轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并以2×104個(gè)/孔接種入小室，37℃過夜培養(yǎng)24 h 后取出上室，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，觀察并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1Real-time PCR、Western blot檢測(cè)PinX1在卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞系中的表達(dá) 結(jié)果顯示，人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、A2780、SKOV3、Caov3中PinX1 mRNA、蛋白表達(dá)水平(依次為0.203±0.099、0.381±0.087、0.172±0.121、0.292±0.069)明顯低于人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(0.69±0.156)，尤其在 SKOV3 細(xì)胞中表達(dá)最低(圖1)。

圖1 Real-time PCR、Western blot檢測(cè)不同卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞系中PinX1的表達(dá)水平Fig.1 Expression of PinX1 level was detected by Real-time PCR and Western blot in four ovarian cancer cells and a normal ovarian epithelial cellsNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05 vs IOSE80 cells,n=3.

圖2 Real-time PCR、Western blot 分別在mRNA與蛋白水平檢測(cè) PinX1過表達(dá)效率Fig.2 Expression of PinX1 mRNA and protein levels was detected by Real-time PCR and Western blot,respectivelyNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05 vs vector group,n=3.

圖3 CCK-8 檢測(cè)過表達(dá)PinX1 基因?qū)KOV3 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 SKOV3 cells were transfected with vector or pCMV-N-Flag-PinX1 plasmid and cell proliferation was evaluated by CCK-8 assayNote: **.P<0.01,vs vector group,n=3.

2.2Real-time PCR、Western blot 驗(yàn)證PinX1 過表達(dá)效率 結(jié)果顯示，PinX1組中PinX1基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，對(duì)照組中PinX1蛋白表達(dá)為0.181±0.109，過表達(dá)組為0.892±0.094，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,P<0.05)，提示PinX1 基因被有效過表達(dá)。

2.3過表達(dá)PinX1對(duì)人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖能力的影響 采用 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞貼壁后24、48、72、96 h的光密度值并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示與vector組相比，PinX1組中細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯下降，提示過表達(dá) PinX1對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)存在抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3，P<0.01)。

2.4過表達(dá)PinX1對(duì)人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PinX1組中細(xì)胞量較對(duì)照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 4，P<0.05)，提示過表達(dá)PinX1可抑制 SKOV3 細(xì)胞侵襲能力。

2.5過表達(dá)PinX1對(duì)卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞c-myc，MMP2 表達(dá)的影響 結(jié)果顯示， 對(duì)照組與過表達(dá)組中c-myc蛋白表達(dá)分別為0.871±0.09、0.435±0.141，MMP2蛋白表達(dá)分別為0.622±0.11、0.312±0.08，PinX1組中c-myc、MMP2表達(dá)水平明顯低于vector 組(圖 5)，提示過表達(dá)PinX1能抑制 c-myc 和MMP2的表達(dá)。

圖4 過表達(dá)PinX1對(duì)SKOV3 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Results of Transwell Matrigel invasion assay of SKOV3 cells with PinX1 up-regulationNote: **.P<0.01 vs vector group,n=3.

圖5 過表達(dá)PinX1對(duì)c-myc、MMP2表達(dá)的影響Fig.5 Expression of MMP2 and c-myc detected by Real-time PCR and Western blotNote: A.c-myc expression；B. MMP2 expression；*.P<0.01 vs vector group,n=3.

3 討論

癌基因的激活、抑癌基因的失活以及它們彼此相互作用的失衡是腫瘤形成的主要原因，因而，探索與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)重要基因及其所介導(dǎo)的信號(hào)通路將有助于揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，為卵巢癌的診療提供重要的分子生物學(xué)依據(jù)。

前期研究顯示，與正常卵巢上皮組織相比PinX1在卵巢癌組織中明顯低表達(dá)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期密切相關(guān)[10]，然而其具體的分子作用機(jī)制卻鮮為人知。為此，本研究首先分析了PinX1在人正常卵巢上皮細(xì)胞和不同卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，Real-time PCR、Western blot結(jié)果顯示 PinX1在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，提示其可能作為抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與先前在臨床組織的研究結(jié)果一致。為了進(jìn)一步探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)制，本研究通過構(gòu)建pCMV-N-Flag-PinX1過表達(dá)重組載體，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，并分別在mRNA 和蛋白水平檢測(cè)PinX1在細(xì)胞中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示PinX1表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示PinX1基因被有效過表達(dá)，而穩(wěn)定過表達(dá)PinX1載體的成功構(gòu)建可能為基因的靶向治療提供有力的工具。此外，CCK8、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)PinX1后，SKOV3 細(xì)胞活力受到抑制，細(xì)胞侵襲能力顯著降低，提示在卵巢癌細(xì)胞中，低表達(dá)的PinX1可能促進(jìn)了卵巢癌的惡性增殖，且與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

近年來研究顯示，腫瘤的發(fā)生過程中涉及眾多基因的表達(dá)異常，例如c-myc、MMP2在乳腺癌、肺癌、食管癌多種實(shí)體瘤組織中呈高表達(dá)趨勢(shì)[11,12]。c-myc作為myc基因家族的重要成員之一，通過直接響應(yīng)有絲分裂信號(hào)，參與腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程。金屬基質(zhì)蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2) 通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[13]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)下調(diào)c-myc、MMP2基因表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力[14-16]。在此基礎(chǔ)上，本研究為了揭示過表達(dá)PinX1導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲能力下降的原因，進(jìn)一步檢測(cè)了c-myc、MMP2蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示 c-myc、MMP2表達(dá)明顯降低，提示PinX1可能通過調(diào)控c-myc、MMP2蛋白表達(dá)而影響卵巢癌的增殖、侵襲能力。此外，大量的研究證實(shí)c-myc、MMP2是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游重要靶基因，磷酸化的β-catenin通過與T細(xì)胞因子家族轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)相互作用，進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[17,18]。由此提示我們，PinX1可能通過參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)活化調(diào)節(jié)c-myc、MMP2的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的增殖與侵襲，而 PinX1 如何靶定其相關(guān)分子來介導(dǎo)這一過程目前仍不明確，有待更進(jìn)一步的探索。

綜上所述，卵巢癌中低表達(dá)的PinX1通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲，參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，相信隨著對(duì)PinX1基因功能研究的完善，其必將成為診斷和治療卵巢癌的新靶點(diǎn)。