郭 成，郭婷婷，胡丹丹，張力莉，徐曉鋒

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

低聚異麥芽糖是α-1，6-糖苷鍵相連的低聚糖類，是功能性寡糖的一種，對腸道微生物菌群具有調(diào)節(jié)作用[1-2]。Zhang等[3]在肉雛雞的基礎(chǔ)日糧添加0.3%、0.6%、0.9%和 1.2%的異麥芽糖，結(jié)果表明，雛雞的生長性能得到提高，而且在補充異麥芽糖后，十二指腸消化道中異丁酸和乙酸的含量降低。S.N.Thitaram等[4]給雞添加低聚異麥芽糖會顯著增加雞盲腸雙歧桿菌數(shù)量。張建斌等[5]研究報道日糧添加0.3%低聚異麥芽糖在一定程度上能夠替代抗生素，顯著增加雞的盲腸和回腸雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。A.Ketabi等[6]發(fā)現(xiàn)低聚異麥芽糖可以刺激大鼠腸道中乳酸桿菌的生長。王少光等[7]研究表明低聚異麥芽糖也能促進(jìn)小鼠腸道雙歧桿菌的增值，顯著降低大腸桿菌數(shù)量，對腸道乙酸、丁酸等揮發(fā)酸模式存在顯著影響。陳國旺等[8]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺與低聚異麥芽糖互作會顯著增加豬腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌的增值。大量研究表明低聚異麥芽糖能夠促進(jìn)單胃動物和雞腸道有益菌群的增值，改變腸道揮發(fā)酸模式。

近年來異麥芽糖在反芻動物上的研究也逐步開展。王新峰等[9]在斷奶羔羊上研究表明，低聚異麥芽糖會降低瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量。祁茹等[10]研究發(fā)現(xiàn)低聚異麥芽糖也能顯著降低成年反芻動物奶山羊的腸道大腸桿菌數(shù)量。反芻動物與單胃動物的最大不同在于瘤胃系統(tǒng)，瘤胃存在纖毛蟲、真菌以及大量細(xì)菌，低聚異麥芽糖對單胃動物腸道菌群的作用已經(jīng)很清楚，對瘤胃菌群的作用尚不清晰。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在奶牛基礎(chǔ)日糧中添加60 g低聚異麥芽糖可以改變奶牛瘤胃中揮發(fā)酸的比例，提高瘤胃中丁酸的發(fā)酵比例[11]。這對于提高牛奶的乳脂合成具有潛在意義，但具體機制還不清楚。本研究擬從瘤胃微生物區(qū)系去探討低聚異麥芽糖對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

選擇4頭泌乳中國荷斯坦奶牛作為試驗動物，分為對照組和試驗組。奶牛日產(chǎn)奶量30 kg左右、體重為550 kg左右。根據(jù)NRC（2001）奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，精粗比為 40∶60（DM 基礎(chǔ)，m:m），日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。采用TMR飼喂方式，全天自由飲水。

表1 奶牛試驗日糧組成及營養(yǎng)成分Table 1 Dietary composition and nutritional composition of dairy cows%

1.2 試驗設(shè)計

將4頭試驗牛隨機分為2組，每組兩頭牛，一組為對照組（CK），一組為實驗組（IOT）。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂基礎(chǔ)飼糧并同時添加60 g/頭低聚異麥芽糖（純度為90%，鄭州文翔化工產(chǎn)品有限公司），通過口腔灌注添加，在早晚飼喂前分兩次灌注。采用兩階段試驗設(shè)計，第一階試驗結(jié)束，經(jīng)過恢復(fù)期后，再將試驗組和對照組交叉，由之前對照組變?yōu)樵囼灲M，每階段對照組和試驗組重復(fù)數(shù)為2，合并后每組n=4。試驗每階段21 d，其中預(yù)飼期7 d，正式期14 d。

1.3 樣品的采集與處理

使用負(fù)壓吸取裝置（自行設(shè)計），通過奶?？谇会娂鑫敢骸２杉瘯r間分別為飼喂前（0 h）及飼喂后2、4、6 h取樣，每次取瘤胃液50 mL。為獲得具有代表性的樣品，每天4個時間點所取的瘤胃內(nèi)容物樣品經(jīng)混勻后各取5 mL，充分混合，轉(zhuǎn)入凍存管放液氮臨時保存，轉(zhuǎn)移到試驗室放-80℃冰箱保存。

1.4 DNA樣品提取、擴增

1.4.1 DNA 提取

取2 mL瘤胃液提取瘤胃微生物DNA，采用試劑盒法，試劑盒采購于南京建成生物研究所。

1.4.2 PCR 擴增

PCR擴增前用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度和濃度，于離心管中取適量的樣品進(jìn)行稀釋。將稀釋后的基因組DNA作為模板。瘤胃液DNA擴增目的片段為V3+V4區(qū)，大概長度468 bp，引物序列為：V3+V4：341F-806R[12]。

341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；

806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT

1.5 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；依照PCR產(chǎn)物濃度的檢測結(jié)果進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用南京建成生物研究所提供的回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.6 Miseq測序及數(shù)據(jù)

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行Miseq測序，其測序采用Miseq 2500 PE 250平臺，數(shù)據(jù)由平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05作為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA質(zhì)檢結(jié)果

對瘤胃液樣品的總DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，濃度及純度均符合IlluminaMiseq平臺測序要求。

2.2 奶牛瘤胃細(xì)菌菌群序列及多樣性分析

2.2.1 瘤胃細(xì)菌菌群 OTUs比較

經(jīng)IlluminaMiseq測序結(jié)束后，除去低質(zhì)量序列，通過序列拼接，應(yīng)用Mothur根據(jù)97%的序列相似度，對序列進(jìn)行OTU聚類，對樣品進(jìn)行OTU的統(tǒng)計，剔除稀有OTU后對照組CK樣品獲得2734個，試驗組IOT樣品獲得2 593個。樣品間差異不顯著（P＞0.05），兩個樣品共享OTU為1 434個（見圖1）。

圖1 低聚麥芽糖對瘤胃細(xì)菌菌群基因OTU分布的影響Figure 1 Effect of isomaltooligosaccharides on the distribution of ruminal bacterial flora gene OTU

2.2.2 瘤胃細(xì)菌alpha多樣性分析

基于OTU的結(jié)果，計算樣品的alpha多樣性，如表2所示。對照組和試驗組樣品的alpha多樣性結(jié)果見表2。由表2可知飼喂低聚異麥芽糖組奶牛瘤胃細(xì)菌菌群的chao值和ace值與對照組比較差異不顯著，說明飼喂低聚異麥芽糖使瘤胃細(xì)菌多樣性無顯著影響。與對照組比較瘤胃細(xì)菌菌群的Shannon指數(shù)比較，說明飼喂低聚異麥芽糖組奶牛瘤胃菌群種類分布均勻度有升高的趨勢（P＜0.1）。本試驗的瘤胃液樣品的Shannon曲線見圖2。如圖所示，當(dāng)測序深度達(dá)到5 000 reads時，曲線趨于平緩，各樣品達(dá)到飽和狀態(tài)，表明本試驗的測序深度可以覆蓋各樣品中大多數(shù)微生物。

表2 樣品在0.03距離下的Alpha豐富程度表Table 2 Alpha richness table of samples at 0.03 distance

圖2 低聚麥芽糖對瘤胃細(xì)菌菌群基因Shannon指數(shù)的影響Figure 2 Effect of isomaltooligosaccharides on Shannon of ruminal bacterial flora gene

2.2.3 瘤胃細(xì)菌的beta多樣性分析

Beta diversity值越接近0，表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。試驗組和對照組的beta多樣性分析結(jié)果見圖3。如圖所示，從圖形上觀察，試驗組和對照組相比，（即IOT-1和CK-3、IOT-2和 CK-4、IOT-3 和 CK-1、IOT-4 和 CK-2），發(fā)現(xiàn)試驗組較對照組相比顏色有變化，且beta diversity值均超過0.02，說明奶牛日糧中添加異麥芽糖可以改變瘤胃細(xì)菌菌群的多樣性。

2.3 奶牛瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 瘤胃細(xì)菌在門水平上的結(jié)構(gòu)分析

從門水平上分析，圖4可以直觀反映出試驗組和對照組采集的樣品中所含的主要細(xì)菌門主要為Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Proteobacteria（變形細(xì)菌門），占到了總細(xì)菌門比例的95%以上。

圖4 不同處理組門水平上的菌群結(jié)構(gòu)Figure 4 Microbial structure at phylum level in different treatment groups

2.3.2 瘤胃細(xì)菌在屬水平上的結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)一步研究到屬水平，分析瘤胃種群結(jié)構(gòu)。圖5為屬水平上瘤胃細(xì)菌的種群組成。由圖5也可知，Prevotella（普雷沃式菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）和Ruminococcus（瘤胃球菌屬）這4種細(xì)菌屬占總菌屬的60%左右。

2.3.3 低聚異麥芽糖對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

以門水平和屬水平為代表，分析瘤胃菌群微生物變化。兩組試驗牛瘤胃液中總細(xì)菌共涉及25個門，225個屬。本表共列出7個門，24個屬。由表3可知，在門水平上，在日糧中添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃Verrucomicrobia（疣微菌門）豐度顯著增加（P＜0.05），其他菌門豐度無明顯變化。在屬水平上，Prevotella（普雷沃式菌屬）、NA（未注釋菌屬）、S24-7_NA、Ruminococcaceae_NA（未注釋瘤胃球菌屬）、Ruminococcus（瘤胃球菌屬）、Prevotellaceae_NA（未注釋普雷沃式菌屬）、Lachnospiraceae_NA（未注釋毛螺旋菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）、Succinivibrionaceae_NA（未注釋琥珀酸弧菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌屬）和Treponema（密螺旋體屬)和Coprococcus（糞球菌屬）共11個菌屬豐度占整體的91%以上。由表3可知，飼喂低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃液Comamonadaceae_NA（未注釋叢毛單胞菌屬）豐度極顯著提高（P＜0.01），WCHB1-25_NA 豐度極顯著增加（P＜0.01），Ruminobacte（瘤胃桿菌屬）豐度顯著增加（P＜0.05），鹽細(xì)菌屬 Salinibacterium 豐度顯著增加（P＜0.05），Lactobacillus（乳酸桿菌屬）豐度顯著降低（P＜0.05）。Acidaminococcus（氨基酸球菌屬）、Aerom-icrobium（氣微菌屬）、Actinotalea、Adlercreutzia菌屬豐度有增加趨勢（0.05＜P＜0.1），TMEG_NA 菌屬豐度有降低的趨勢（0.05＜P＜0.1）。

圖5 不同處理組屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)Figure 5 Microbial structure at genus level in different treatment groups

3 討論

反芻動物瘤胃中的微生物將纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)成分和能源物質(zhì)供機體吸收利用。由細(xì)菌，真菌，原蟲以及古細(xì)菌等組成的瘤胃微生物群體，成為了宿主反芻動物必不可少的共生關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。反芻動物瘤胃細(xì)菌中的，優(yōu)勢菌群為擬桿菌門，厚壁菌門，纖維桿菌和變形菌門[13]。本試驗中，在添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性無顯著性差異。祁茹等[14]報道的低聚異麥芽糖對瘤胃液細(xì)菌總數(shù)沒有產(chǎn)生顯著性影響。閔力[15]通過PCR-DGGE技術(shù)研究功能性寡糖組合對錦江黃牛瘤胃固相細(xì)菌的多樣性發(fā)現(xiàn)，日糧中添加功能性寡糖增加了棲瘤胃普雷沃氏菌屬，提高瘤胃中微生物的多樣性。王新峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊飼糧中添加低聚異麥芽糖及混合低聚糖對瘤胃細(xì)菌的多樣性無顯著影響，添加低聚異麥芽糖對反芻動物瘤胃細(xì)菌菌群多樣性影響的報道結(jié)果并不一致，低聚異麥芽糖對瘤胃菌群多樣性影響有可能與動物種類，發(fā)育階段以及寡糖添加量有關(guān)。

粗飼料是反芻動物最主要的飼料來源，細(xì)菌在分解利用纖維素過程中起主要作用，其中纖維素降解菌起重要作用。纖維降解菌通過酶的催化使纖維素和半纖維素分解為瘤胃能夠吸收的小分子物質(zhì)，纖維物質(zhì)的降解需要在各種酶的協(xié)同作用下完成，酶活性的改變會影響纖維物質(zhì)的降解[17-20]。林英庭等[21]研究表明，在山羊的日糧中添加1%的低聚異麥芽糖，可以顯著提高纖維降解酶活性，提高纖維降解率。本試驗中，添加低聚異麥芽糖后，發(fā)現(xiàn)添加低聚異麥芽糖并未顯著改變瘤胃球菌、纖維桿菌屬等主要瘤胃纖維降解菌的豐度。添加外源寡糖可以提高常用飼料的干物質(zhì)瘤胃消失率，祁茹[22]在山羊日糧中添加低聚異麥芽糖，發(fā)現(xiàn)玉米，豆粕，羊草，苜蓿青干草的瘤胃消失率顯著提高。反芻動物精飼料多為淀粉構(gòu)成，在降解淀粉中起著突出作用的瘤胃細(xì)菌包括普雷沃氏菌屬，梭菌屬，牛鏈球菌屬，產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌屬，嗜淀粉瘤胃桿菌和反芻動物月形單胞菌等[23]。本研究表明，日糧添加低聚異麥芽糖對奶牛瘤胃液瘤胃桿菌屬豐度提高顯著，可促進(jìn)瘤胃內(nèi)淀粉的分解代謝。

高精日糧會導(dǎo)致瘤胃酸中毒或亞急性酸中毒，當(dāng)瘤胃處于酸中毒或者亞急性瘤胃酸中毒時，瘤胃發(fā)酵模式和脂肪酸乳腺的分泌會發(fā)生改變[24-25]。研究表明，當(dāng)奶牛發(fā)生亞急性酸中毒時可引起乳脂下降[26]。乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌之間的菌群平衡紊亂，使瘤胃內(nèi)乳酸積累，是誘發(fā)瘤胃酸中毒的主要原因[27-28]。瘤胃內(nèi)乳酸產(chǎn)生菌主要有溶纖維丁酸弧菌、牛鏈球菌、乳酸桿菌等[29]。本試驗中，日糧添加低聚異麥芽糖，奶牛瘤胃乳酸生成菌乳酸桿菌豐度顯著降低，這對于調(diào)控瘤胃pH有一定意義。

表3 低聚異麥芽糖對瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of isomaltooligosaccharides on the structure of bacterial flora in rumen%

4 結(jié)論

本試驗利用16SrRNA基因高通量測序技術(shù)分析奶牛瘤胃細(xì)菌菌群在添加低聚異麥芽糖后的變化，發(fā)現(xiàn)在日糧中添加低聚異麥芽糖后，奶牛瘤胃細(xì)菌菌群多樣性無顯著差異，并未顯著改變瘤胃纖維菌群等主要瘤胃纖維降解菌的豐度，降解淀粉瘤胃桿菌屬顯著提高，乳酸生成菌乳酸桿菌豐度顯著降低。