馮 爍，張亞飛，栗云鵬，楊佐君，孫英健

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

牛角地黃湯源于唐代《千金備急藥方》，是由犀角、地黃、丹皮、赤芍四種主要成分組成[1]，目前原方中的犀角由牛角替代。牛角地黃湯在臨床上被公認(rèn)為是治療溫病血分證候的代表方劑，具有涼血散瘀、清熱解毒的功效[2]，現(xiàn)代中醫(yī)常將本方用于治療急性重癥肝炎、肝昏迷、尿毒癥、過敏性紫癜、敗血癥等血分熱盛型疾病。金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌，Staphylococcus aureus），有“嗜肉菌”的別稱，致病力強(qiáng)，能產(chǎn)生的多種毒素和酶類，如溶血素（hemolysin）[3]、腸毒素（enterotoxin）[4]、毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）[5]、凝固酶（coagulase）[6]等是細(xì)菌產(chǎn)生的重要的毒力因子。動(dòng)物感染金葡菌可引起機(jī)體局部化膿性感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至敗血癥、膿毒血癥等嚴(yán)重的全身感染[7]。特別是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）幾乎遍及全球，感染率和死亡率都較高[8]，多藥物耐藥的MRSA出現(xiàn)，增加了控制細(xì)菌感染的難度[9-10]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)部分中藥具有降低細(xì)菌耐藥性的作用[11-13]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，牛角地黃湯具有抑制金葡菌毒力因子溶血素活性及溶血素、腸毒素等毒力因子分泌的作用[14]。但牛角地黃湯對(duì)金葡菌耐藥性的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在研究牛角地黃湯對(duì)金葡菌對(duì)金葡菌苯唑西林鈉耐藥性及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

金葡菌ATCC-29213和ATCC-43330購自鼎國生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

水牛角、生地黃、赤芍、丹皮購自北京同仁堂藥店；MHB培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；苯唑西林鈉購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金葡菌對(duì)苯唑西林鈉的耐受性檢測

以不含藥物的細(xì)菌培養(yǎng)組為陰性對(duì)照組，給予兩種金黃色葡萄球菌ATCC-29213、ATCC-43300培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯唑西林鈉（2～512 μg/mL），于37℃溫箱中培養(yǎng)6 h，觀察細(xì)菌的生長情況。以培養(yǎng)基不發(fā)生渾濁，或OD值為陰性對(duì)照組OD值10%以下表示細(xì)菌增殖被抑制。

1.2.2 牛角地黃湯對(duì)金葡菌的苯唑西林鈉耐受性的影響

以只加苯唑西林鈉溶液的細(xì)菌培養(yǎng)組為陽性對(duì)照組，以不含藥的細(xì)菌培養(yǎng)組為陰性對(duì)照組，以含牛角地黃湯的MHB培養(yǎng)基為藥物對(duì)照組、試驗(yàn)組給予牛角地黃湯（2.5、5、10 mg/mL）和不同濃度的苯唑西林鈉（2～512 μg/mL）溶液（見表 1），接種金黃色葡萄球菌ATCC-29213，37℃溫箱中培養(yǎng)6 h，觀察細(xì)菌的生長情況。

表1 試驗(yàn)組處理方案Table 1 Treatment scheme of test group

1.2.3 牛角地黃湯對(duì)金葡菌基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，測OD值，并稀釋到OD600=0.5時(shí)，分裝菌液于4個(gè)試管中，加入不同濃度的牛角地黃湯（0、2.5、5、10 mg/mL），繼續(xù)在 37℃，150 rpm搖床中培養(yǎng)，5 h后收集菌體，液氮保存，送到華大基因進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測。

常規(guī)方法提取樣品總RNA后，用試劑盒去除rRNA后進(jìn)入下一步。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后去除 dNTPs后，加入緩沖液、dATP，dGTP，dCTP，dUTP、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加polyA并連接測序接頭，然后用UNG酶消化第二條cDNA鏈，連接產(chǎn)物經(jīng)MiniElute PCR Purification Kit純化后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測序文庫用Illumina HiSeq2000進(jìn)行測序。獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)處理去除含adaptor的reads，去除N的比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read的40%以上）.獲得Clean reads，選擇foldchange＞2的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，以S.aureus NCTC8325的基因組為參考基因組，將這些差異表達(dá)的基因同參考基因組進(jìn)行比對(duì)，利用cluster軟件，對(duì)差異表達(dá)基因和實(shí)驗(yàn)條件同時(shí)進(jìn)行等級(jí)聚類分析。

1.2.4 金黃色葡萄球菌抗性相關(guān)基因表達(dá)分析

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌至OD600=0.5，分裝于5個(gè)試管中，加入不同濃度的牛角地黃湯劑（0、2.5、5、10 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，分別取經(jīng)離心的各組菌懸液，用PBS清洗3遍，分別向菌體沉淀中加入80 μL的TE緩沖液，震蕩懸浮，加入終濃度為50 μg/mL的溶菌素及10 mg/mL的溶菌酶，于37℃水浴鍋中水浴10 min，然后加入Trizol抽打混勻，按照程序提取mRNA，并立即檢測RNA純度和濃度。

應(yīng)用康為世紀(jì)HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CW0744）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，選取合適引物（見表1）做PCR反應(yīng)，PCR循環(huán)基本條件：第一階段95℃預(yù)變性2 min，第二階段95℃變性 30 s，50～55℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。所有樣品均為三個(gè)平行，以16S rRNA為內(nèi)參，采用電泳條帶灰度分析作為基因的相對(duì)表達(dá)水平。目的基因相對(duì)表達(dá)水平=目的基因灰度值/16s灰度值

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林鈉耐受性的結(jié)果

金葡菌ATCC-29213與金葡菌ATCC-43300在2～512 μg/mL苯唑西林鈉不同濃度的作用下，均有菌株生長（見圖1），且在低于512 μg/mL濃度時(shí)細(xì)菌的存活率均高于10%，說明這兩株金葡菌對(duì)苯唑西林鈉都具有耐藥性，金葡菌ATCC-29213比ATCC-43300菌株的耐藥性更強(qiáng)。在后續(xù)的試驗(yàn)中選擇金葡菌ATCC-29213為試驗(yàn)菌株。

圖1 金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林耐受性檢測Figure 1 The tolerance test of Staphylococcus aureus to oxacillin

2.2 牛角地黃湯對(duì)苯唑西林鈉抑菌作用的影響

苯唑西林濃度為512 μg/mL時(shí)金葡菌仍可生長，MIC高于512 μg/mL，表明其對(duì)苯唑西林具有耐藥性。當(dāng)加入牛角地黃湯后苯唑西林在256 μg/mL和512 μg/mL的培養(yǎng)孔中金葡菌的增殖明顯被抑制金葡菌的存活率菌小于10%，在苯唑西林鈉濃度為128 μg/mL 時(shí)，高劑量的牛角地黃湯（20 mg/mL）對(duì)金葡菌的增殖抑制作用最強(qiáng)，存活率低于10%。在苯唑西林鈉濃度低于128 μg/mL時(shí)，金葡菌的增殖活性隨著牛角地黃湯的濃度增高而顯著降低，與不加牛角地黃湯的對(duì)照組差異顯著（P＜0.05，圖 2）。結(jié)果提示牛角地黃湯能增加耐藥金葡菌ATCC-29213菌株對(duì)苯唑西林鈉的敏感性，而且隨著牛角地黃湯的濃度增高，金葡菌的增殖被抑制得更加明顯。

圖2 牛角地黃湯對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC-29213耐藥性的影響Figure 2 The effect of Niujiaodihuang decoction on the drug resistance of Staphylococcus aureus ATCC-29213

2.3 牛角地黃湯對(duì)金葡菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

牛角地黃湯作用5 h后與對(duì)照組相比sRNA預(yù)測靶基因差異表達(dá)結(jié)果見圖3。在2.5 mg/mL濃度時(shí)差異sRNA靶基因上調(diào)的基因?yàn)?38，下調(diào)的基因?yàn)?10個(gè)，在5mg/mL濃度時(shí)上調(diào)的sRNA靶基因?yàn)?04，下調(diào)的sRNA靶基因?yàn)?19個(gè)，在10 mg/mL濃度下上調(diào)的sRNA靶基因?yàn)?74，下調(diào)的sRNA靶基因?yàn)?47個(gè)。聚類分析（見圖4）顯示這些基因參與廣泛的生物學(xué)功能，包括增殖、黏附、細(xì)胞周期、細(xì)菌感染、細(xì)菌抗性以及各種糖、脂肪的代謝途徑等。

圖3 預(yù)測差異sRNA靶基因統(tǒng)計(jì)Figure 3 Prediction of differential target genes sRNA statistics

圖4 牛角地黃湯處理后金葡菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因功能聚類分析Figure 4 Niujiaodihuang decoction treatment of Staphylococcus aureuspost transcriptome analysis of differential gene function clustering

根據(jù)信號(hào)通路分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯對(duì)金葡菌細(xì)胞周期及細(xì)菌抗性相關(guān)基因的表達(dá)有明顯的影響。牛角地黃湯參與細(xì)胞周期相關(guān)基因ClpP的上調(diào)和FtsQ、MurG的下調(diào)，根據(jù)細(xì)胞周期信號(hào)通路分析ClpP基因的上調(diào)可抑制細(xì)胞進(jìn)入染色體復(fù)制準(zhǔn)備期G0期，MurG基因和FtsQ基因的下調(diào)可以抑制細(xì)胞進(jìn)入G2/M期[15]，從而使金葡菌的增殖受到影響。glmU、murG基因與細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)，在牛角地黃湯對(duì)金葡菌的抗生素抗性基因分析顯示，牛角地黃湯在濃度為2.5 mg/mL時(shí)，MurG基因上調(diào)，在濃度為10 mg/mL時(shí)，MurG基因下調(diào)，該研究結(jié)果提示，牛角地黃湯可能具有影響金葡菌細(xì)胞壁的合成作用。

2.4 金黃色葡萄球菌抗性相關(guān)基因表達(dá)分析

2.4.1 牛角地黃湯對(duì)金葡菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

牛角地黃湯藥物處理金黃色葡萄球菌后，提取mRNA反轉(zhuǎn)錄得到不同處理組金葡菌的cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR來檢測抗性相關(guān)基因的表達(dá)。所有樣品均為三個(gè)平行，以16S作為內(nèi)參（見圖5）進(jìn)行灰度掃描檢測。

圖5 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌16s PCR電泳圖Figure 5 16s PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

glmU、murG基因是與細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因[16-17]，murG基因主要功能是編碼金黃色葡萄球菌在合成細(xì)胞壁過程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)其表達(dá)增高時(shí)，可有效地改變金葡菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁厚度。牛角地黃湯處理后金葡菌murG、glmU基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢（見圖6）。這提示牛角地黃湯可能對(duì)金葡菌的細(xì)胞壁合成有影響。pbpB是細(xì)菌細(xì)胞壁合成所必需的也是苯唑西林的作用位點(diǎn)[18]，但是，牛角地黃湯對(duì)青霉素結(jié)合蛋白pbpB的mRNA的表達(dá)沒有顯著的影響（見圖6）。

圖6 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌murG、glmU、pbpB基因PCR電泳圖Figure 6 murG，glmU and pbpB genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

2.4.2 牛角地黃湯對(duì)金葡菌毒素及耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響

牛角地黃湯對(duì)耐藥輔助基因femB的表達(dá)呈顯著抑制作用，且具有濃度依賴性，當(dāng)牛角地黃湯濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，其表達(dá)量下降了60%。但對(duì)pbpBR的mRNA的表達(dá)沒有顯著的影響（見圖7）。牛角地黃湯對(duì)金葡菌殺白細(xì)胞毒素pvL基因的表達(dá)，沒有顯著影響（見圖8）。

圖7 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌femB and pbpBR基因PCR電泳圖Figure 7 femB and pbpBR genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

圖8 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌pvL基因PCR電泳圖Figure 8 pvL genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

3 討論

一直以來，人們對(duì)于治療細(xì)菌感染性疾病主要是應(yīng)用抗生素，抗生素類藥物主要通過干擾細(xì)菌的DNA、細(xì)胞壁以及蛋白質(zhì)等重要的生命活動(dòng)而抑殺細(xì)菌，病原微生物在這種選擇性壓力下，很容易通過基因突變、質(zhì)粒轉(zhuǎn)座或改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、代謝途徑等方式獲得針對(duì)不同抗生素的耐藥性[19]。pbpB是細(xì)菌所必需的，在革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁合成過程中起著關(guān)鍵作用[18]，且與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有高親和性，由于pbps種類繁多，當(dāng)高親和力的pbps被β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結(jié)合而失去功能時(shí)，pbpBa的存在仍能維持細(xì)菌的生長，成為耐藥菌株。本研究提示亞抑菌濃度的牛角地黃湯與苯唑西林聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高金葡菌對(duì)苯唑西林的敏感性。并且能參與眾多的生命活動(dòng)的調(diào)控。苯唑西林抑殺金葡菌的機(jī)制主要是作用于金葡菌的pbpB，通過影響菌體結(jié)構(gòu)而抑殺細(xì)菌，因此我們重點(diǎn)關(guān)注了與細(xì)胞壁合成和耐藥相關(guān)的基因，但并未發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯對(duì)pbpB或pbpBR的影響，說明牛角地黃湯對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的干擾作用的位點(diǎn)與苯唑西林不同，pbpB并非牛角地黃湯的作用位點(diǎn)，glmU、murG基因是與細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因[16-17]，牛角地黃湯對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期的干擾作用與murG和glmU基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并且其能降低耐藥相關(guān)基因femB的表達(dá)，這種作用可能是其與苯唑西林有協(xié)同作用的原因之一。在本次轉(zhuǎn)錄組中也發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯能調(diào)控細(xì)胞膜蛋白的表達(dá)、使蛋白質(zhì)的合成發(fā)生變化，糖類和脂肪類的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成也受到控制，在代謝過程中氨基酸代謝過程發(fā)生改變，特別是對(duì)細(xì)菌Agr二元調(diào)控系統(tǒng)關(guān)鍵基因有顯著下調(diào)，該系統(tǒng)與細(xì)菌的感染和致病力密切聯(lián)系[20]，這與我們的前期研究發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯在亞抑菌濃度作用下可抑制金葡菌ATCC-29213毒力因子如溶血素、腸毒素A和B的分泌的結(jié)果相一致。

中藥在預(yù)防細(xì)菌感染方面有顯著效果，單味中藥在體外對(duì)痢疾志賀菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、病原性弧菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌等具有較強(qiáng)的殺菌作用[21]，或具有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的作用[22]。但是中藥制劑十分復(fù)雜，藥物的采集時(shí)間、煎制方法、藥物之間相互作用，均可能對(duì)藥物療效產(chǎn)生一定影響，雖本研究研究推測牛角地黃湯可以與抗生素聯(lián)合應(yīng)用增加金黃色葡萄球菌的敏感性，提高抗生素的藥效和抗感染作用，但是，在臨床對(duì)于治療細(xì)菌性感染是否有效，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

中藥牛角地黃湯與苯唑西林聯(lián)用具有協(xié)同作用，可增加耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株敏感性。其作用位點(diǎn)與pbpB和pbpBR基因的表達(dá)無關(guān)，與金葡菌耐藥基因輔助基因femB的表達(dá)及細(xì)菌細(xì)胞壁的合成murG和glmU的表達(dá)有關(guān)。