劉 嘉，李富貴，覃 飛，苗小猛，于雪珂，楊福領(lǐng)，張 羽，朱 慶，王 彥，尹華東，李地艷，舒 剛，趙小玲*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

綠殼雞蛋不僅殼色特別，而且具有低膽固醇、低脂肪等特性，富含硒、碘、鐵和鋅等多種微量元素[1]，符合市場(chǎng)需求且前景廣闊。目前，成熟的綠殼蛋雞配套系較少，故需在綠殼蛋雞的品種選育上做進(jìn)一步的研發(fā)工作。

綠殼性狀由1號(hào)常染色體顯性綠殼基因（Oocyan，O）控制，與膽色素的合成或分泌有關(guān)，SLC01B3基因（Solute carrier organic anion transporter family member 1B3，SLC01B3）能夠幫助膽鹽類(lèi)物質(zhì)跨膜運(yùn)輸至卵殼腺，卵殼腺上皮細(xì)胞將膽綠素分泌至蛋殼中，使得蛋殼最終呈現(xiàn)綠色。研究表明，由于雞3號(hào)染色體上 EAV-HP（Endogenous avain retrovirus-HP）的長(zhǎng)末端重復(fù)序列轉(zhuǎn)插入到了雞1號(hào)染色體SLCO1B3基因和SLCO1C1基因之間，促使SLC01B3基因過(guò)量表達(dá)，從而產(chǎn)生綠殼蛋[2]。雞綠殼蛋性狀具有顯性遺傳的特點(diǎn)，通過(guò)表型選擇難以徹底剔除隱性等位基因，因而在短期內(nèi)難以將綠殼蛋雞的性狀固定，而采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行基因型的篩選，更為精確、省時(shí)。

四川舊院黑雞是四川省萬(wàn)源市特有的地方品種，其最顯著的特征為烏皮、黑羽、五豆冠、黑脛，在其自然群體中，約有10%～20%的個(gè)體產(chǎn)綠殼蛋。本試驗(yàn)將綠殼蛋分子標(biāo)記應(yīng)用于舊院黑雞公雞綠殼蛋性狀陽(yáng)性純合子鑒定并將其與綠殼蛋雞（LK系）雜交，以期獲得兼具雙親優(yōu)點(diǎn)的雜交組合。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場(chǎng)飼養(yǎng)的舊院黑雞JY系（第二世代）公雞60只、綠殼蛋雞LK系（第二世代）母雞各300只。JY系公雞用于綠殼基因檢測(cè)，選出基因型為陽(yáng)性純合的JY系公雞與LK系母雞進(jìn)行雜交，形成JL雜交組合。將JY系（第三世代）、LK系（第三世代）與JL雜交組合母雞于相同條件下飼養(yǎng)，自由飲水及采食，基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。0～6周齡采用三層重疊式育雛籠飼養(yǎng)，在育成和產(chǎn)蛋階段（7～43周齡）采用兩層階梯單籠飼養(yǎng)。育雛期光照強(qiáng)度為5 lx，光照時(shí)間由第1天的24 h逐漸降為6周齡時(shí)的8 h；育成期及產(chǎn)蛋期光照強(qiáng)度為10 lx，逐漸提升光照時(shí)間到16 h，并持續(xù)整個(gè)產(chǎn)蛋期。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 JY 系公雞綠殼基因檢測(cè)

選取60只JY系公雞，翅下采血，用酚-氯仿法[3]提取血液DNA。并使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè) DNA 濃度，其 OD260/OD280值為 1.8～1.9的為合格樣品，于-20℃下進(jìn)行保存。

應(yīng)用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽育種課題組所公布的引物及PCR擴(kuò)增程序[（《用于鑒別綠殼蛋雞基因型的引物組合物及其應(yīng)用》，發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N 2014102387004）]，對(duì)血樣DNA進(jìn)行擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL于1.5%的瓊脂糖凝膠上在220 V下進(jìn)行電泳，根據(jù)與DNA Marker 2000跑出的標(biāo)準(zhǔn)條帶進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)條帶數(shù)目及大小判斷基因型。其中LS/LS為純合子綠殼蛋基因型，只出現(xiàn)209 bp的條帶；LS/CC為雜合子綠殼蛋基因型，出現(xiàn)209 bp和312 bp的條帶；CC/CC為非綠殼蛋基因型，只出現(xiàn)312 bp的條帶。

1.2.2 雜交模式

將篩選出的JY系綠殼基因顯性純合型個(gè)體作為父本，LK系（第二世代）作為母本，混合精液人工授精，收集種蛋。并純繁得到第三世代JY系和LK系種蛋，相同條件下進(jìn)行種蛋孵化。

1.2.3 生產(chǎn)性能測(cè)定

①孵化性能：記錄入孵蛋的總數(shù)、種蛋受精率、孵化率以及健雛率等。

②早期體重測(cè)定：分別在 2、4、6、8、10 周齡末清晨進(jìn)行稱(chēng)重（停食12 h），3個(gè)群體每次各隨機(jī)抽測(cè)20只。

③產(chǎn)蛋性能指標(biāo)：記錄3個(gè)群體每個(gè)個(gè)體的開(kāi)產(chǎn)日齡、開(kāi)產(chǎn)體重、開(kāi)產(chǎn)蛋重，統(tǒng)計(jì)開(kāi)產(chǎn)到300日齡每天的綠殼蛋率并統(tǒng)計(jì)300日齡的產(chǎn)蛋量（飼養(yǎng)日產(chǎn)蛋數(shù)）、蛋重及個(gè)體重等。

④30周齡蛋品質(zhì)：從30周齡（產(chǎn)蛋高峰期）開(kāi)始連續(xù)收集JY系、LK系及雜交組合3 d的雞蛋，每天每組隨機(jī)抽取10個(gè)進(jìn)行蛋品質(zhì)的測(cè)定。蛋形指數(shù)、蛋殼厚度用游標(biāo)卡尺測(cè)定，蛋殼顏色用光電反射式色度儀測(cè)定，蛋殼強(qiáng)度用蛋殼強(qiáng)度儀測(cè)定，蛋黃顏色、蛋白高度、哈氏單位用 EMT-5200多功能蛋品質(zhì)分析儀測(cè)定，蛋重和蛋黃重用電子秤測(cè)定。

表1 不同階段基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition of basal diets and feed nutrition index at different stages （air-dry basis）

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理后，再用JMP Pro v.10軟件中的一般線(xiàn)性模型（GLM）進(jìn)行方差分析（影響因素為群體），并用Tukey法對(duì)方差分析顯著的結(jié)果進(jìn)行群體間多重比較，顯著水平為0.05，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并計(jì)算雜種優(yōu)勢(shì)率（H）。雜種優(yōu)勢(shì)率計(jì)算公式如下：

其中，H表示雜種優(yōu)勢(shì)率，P1、P2分別代表父本純種均值、母本純種均值，F(xiàn)1代表雜種均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 JY系公雞綠殼蛋基因顯性純合子篩選結(jié)果

本試驗(yàn)從60只JY系公雞血樣中共檢測(cè)到6只顯性純合綠殼基因型個(gè)體（LS/LS）、10只雜合綠殼基因型個(gè)體（LS/CC）以及44只隱性純合基因型個(gè)體（CC/CC）。并將6只顯性純合綠殼基因型個(gè)體用于接下來(lái)的雜交試驗(yàn)。3種帶型分別如圖1所示：

圖1 不同基因型篩選結(jié)果Figure 1 Screening results of different genotypes

2.2 孵化性能及早期體重

從表2可知，JL雜交組合的受精率分別比JY系和LK系高2.53%、5.89%，并表現(xiàn)出明顯的正向雜種優(yōu)勢(shì)。而JL的孵化率比LK系低2.94%，3個(gè)群體的健雛率均較高。

表2 3個(gè)群體主要孵化性能指標(biāo)及雜交組合雜種優(yōu)勢(shì)率Table 2 The hatching performance index of three populations and heterosis percentage

由表3可知，在2周齡和6周齡時(shí)，JL雜交組合和 JY 系的體重均顯著高于 LK 系（P＜0.05），其中，JY的2周齡體重和6周齡體重分別比LK高出19.41%和 22.03%，JL 則分別比 LK 高出 14.65%、25.37%。JL雜交組合早期體重均表現(xiàn)出明顯的正向雜種優(yōu)勢(shì)，且在第6周時(shí)優(yōu)勢(shì)率最高（H=12.93%）。

表3 3個(gè)群體早期體重及雜交組合雜種優(yōu)勢(shì)率Table 3 The early body weight of three populations and heterosis percentage

2.3 JY系、LK系及雜交組合母雞外貌特征

JY系母雞為烏色豆冠、烏喙、藍(lán)耳、黑脛，體覆烏羽且富有光澤；LK系母雞為紅色單冠、黑灰色喙、粉紅耳、灰脛、黑羽，色澤較JY系暗；JL雜交組合母雞為烏色單冠、烏喙、藍(lán)耳、黑脛、烏羽（見(jiàn)圖2）。

圖2 JY系（A）、LK系（B）和JL雜交組合母雞（C）外貌特征Figure 2 The appearance of JY （A）， LK （B）and the cross JL （C）

2.4 產(chǎn)蛋性能

從表4可知，JL雜交組合開(kāi)產(chǎn)日齡比LK系早13 d，比JY系早34 d，表現(xiàn)出明顯的負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)（H=-15.41%）。JL的開(kāi)產(chǎn)體重輕于JY系和LK系，但開(kāi)產(chǎn)蛋重卻高于二者（P＜0.05）。JL雜交組合300日齡體重與LK系相當(dāng)，比JY系低14.61%。JL的開(kāi)產(chǎn)體重與300日齡體重均表現(xiàn)出明顯的負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)，開(kāi)產(chǎn)蛋重則為正向雜種優(yōu)勢(shì)。三者間300日齡蛋重?zé)o顯著差異（P＞0.05），雜交組合 300 日齡產(chǎn)蛋量最高，分別比JY系和LK系多25.12枚、5.31枚，雜種優(yōu)勢(shì)率為22.94，且雜交組合綠殼蛋率接近100%。

表4 3個(gè)群體主要產(chǎn)蛋性能指標(biāo)及雜種優(yōu)勢(shì)率Table 4 The laying performance of three populations and heterosis percentage

2.5 蛋品質(zhì)

從表5可知，JY系雞蛋的蛋殼顏色、蛋白高度及哈氏單位為三者中最高，且JY系和LK系的蛋重、蛋黃顏色均高于 JL 雜交組合（P＜0.05）；LK 系的蛋黃顏色最深，蛋白高度和哈氏單位次于JY系而高于JL；JL的蛋殼厚度分別比LK系和JY系高出70.37%、43.75%，蛋殼強(qiáng)度分別比 LK系和 JY 系高出 25.54%、9.74%；三者之間的蛋形指數(shù)、蛋黃重差異不顯著（P＞0.05）。JL的蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋形指數(shù)、蛋黃重均表現(xiàn)為正向雜種優(yōu)勢(shì)，殼色、蛋重、蛋黃顏色、哈氏單位及蛋白高度則為負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)。

表5 3個(gè)群體蛋品質(zhì)及雜交組合雜種優(yōu)勢(shì)率Table 5 The egg quality of three populations and the heterosis percentage

3 討論

3.1 JY系公雞綠殼蛋基因篩選

綠殼蛋雞是攜帶綠殼蛋基因而生產(chǎn)綠殼蛋的雞種（品系）。原始狀態(tài)下，綠殼蛋雞群體中的綠殼基因頻率較低，僅有20%～30%。由于該性狀為常染色體顯性遺傳，表型選育中因雜合子的存在使得綠殼蛋性狀選而不純，影響選育進(jìn)展[4]。本試驗(yàn)采用雙重PCR的方法對(duì)JY系公雞進(jìn)行基因型的篩選，結(jié)果表明，所檢測(cè)60個(gè)個(gè)體中攜帶綠殼基因的比例為23%，所占比例少，同時(shí)也說(shuō)明在現(xiàn)代家禽育種工作中，采用分子輔助遺傳標(biāo)記技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)能夠極大提高育種的工作效率。

3.2 外貌特征及生產(chǎn)性能

不同種群之間進(jìn)行雜交后所產(chǎn)生的后代通常在生活力、生長(zhǎng)速度和生產(chǎn)性能方面在一定程度上優(yōu)于兩個(gè)親本種群的平均值，甚至優(yōu)于任何一個(gè)親本，謂之“雜種優(yōu)勢(shì)”[5]。雜種優(yōu)勢(shì)是一種重要的、可利用的遺傳現(xiàn)象，通常以配套系的形式運(yùn)用于家禽生產(chǎn)中，一般情況下以相對(duì)高產(chǎn)的品種（系）作為母本，以地方特色品種（系）作為父本，進(jìn)行雜交組合后，以期獲得生產(chǎn)性能更為優(yōu)秀的商品代群體。

外貌是一個(gè)群體最直觀的特征，我國(guó)消費(fèi)者因?yàn)蹼u特有的藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值及觀賞價(jià)值而對(duì)其倍加青睞。JL雜交組合母雞為烏色單冠、烏喙、藍(lán)耳、烏皮、黑脛、烏羽，體型較小，其外貌特征符合市場(chǎng)要求。JL的膚色、脛色、冠色與JY系一致，而冠型則與LK系一致。有研究表明，質(zhì)量性狀冠型由R基因（玫瑰冠）和P基因（豆冠）這兩對(duì)互作基因控制，遵循孟德?tīng)栠z傳定律。其中，單冠（pprr）為雙隱性，豆冠（P-rr）則顯性于單冠[6]，所選用的JY公雞均為豆冠，LK母雞均為單冠，而雜交后代JL則表現(xiàn)為單冠，故推測(cè)所選用的JY系公雞冠型的基因型應(yīng)為Pprr，但因JL群體數(shù)量不大而未實(shí)現(xiàn)性狀分離，另一種情況或?yàn)榕f院黑雞冠型遺傳規(guī)律并不同于其他家雞，其具體分子機(jī)制尚待研究。淺膚色顏色主要受葉黃素含量的影響，白色相對(duì)于黃色為顯性[7]。而黑色素的沉積則會(huì)造成家禽皮膚及衍生組織的黑色性狀，主要受常染色體上的顯性基因（P）及性染色體上的隱性色素?cái)U(kuò)散基因（id）二者共同影響，當(dāng)有P時(shí)，黑色素細(xì)胞將遍布家禽渾身結(jié)締組織，而id無(wú)論是雜合還是純合情況下均使家禽的真皮層存在黑色素，而控制烏骨雞膚色的基因有隱性伴性基因（id）和顯性色素基因（Fm），且顯性黑色素增色基因P和Fm具有相同的作用[8]。LK系為淺黃色皮膚，JY系為烏皮，雜交組合的皮膚及其衍生物呈現(xiàn)出深色亦符合遺傳定律。

低遺傳力的性狀雜種優(yōu)勢(shì)更為明顯，如受精率、孵化率和成活率等[9]。本試驗(yàn)中，JY系和LK系的受精率分別為94.29%和90.93%，而雜交后代的受精率為 96.82%，表現(xiàn)出較高的正向雜種優(yōu)勢(shì)（H=4.55%），與嚴(yán)華祥等[10]研究結(jié)果相符。王宏勝等研究表明，京海黃雞三系配套系商品代孵化率優(yōu)于親本[11]，而本研究中孵化率高低依次為L(zhǎng)K＞JL＞JY，JL雜交組合孵化率介于兩個(gè)純系之間，且雜種優(yōu)勢(shì)并不明顯。

體重是衡量機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育狀況的指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，JL雜交組合2～10周的體重與JY系和LK系相比均表現(xiàn)出不同程度的正向雜種優(yōu)勢(shì)，與以往研究結(jié)果[12]一致，表明JL的早期體重發(fā)育較為良好，可為后期較早的開(kāi)產(chǎn)日齡打下基礎(chǔ)[13]。JL雜交組合開(kāi)產(chǎn)日齡早于JY系和LK系，為129 d左右，與汪全生等報(bào)道的“京粉1號(hào)”父母代蛋種雞123～138日齡開(kāi)產(chǎn)相符[14]。彭星等研究表明，二郎山山地雞開(kāi)產(chǎn)日齡與300日齡產(chǎn)蛋量均呈顯著負(fù)相關(guān)[15]，且在實(shí)際生產(chǎn)中，與經(jīng)濟(jì)價(jià)值密切相關(guān)的蛋雞整個(gè)產(chǎn)蛋期總產(chǎn)蛋量是人們最關(guān)注的內(nèi)容之一[16]，本研究中JL開(kāi)產(chǎn)日齡最早且300日齡產(chǎn)蛋量最高，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，而3個(gè)群體300日齡蛋重?zé)o明顯差異，說(shuō)明該雜交組合的產(chǎn)蛋性能優(yōu)于其親本JY系與LK系。

3.3 蛋品質(zhì)測(cè)定結(jié)果分析

在本試驗(yàn)中，采用分子標(biāo)記對(duì)父本舊院黑雞進(jìn)行基因型的篩選，使得JL雜交組合群體均攜帶綠殼性狀基因，綠殼蛋產(chǎn)率為100%，與預(yù)期結(jié)果相符。鄧炳真等研究表明，南海黃麻雞產(chǎn)蛋高峰階段的蛋品質(zhì)達(dá)到全期最好水平[17]，故本研究對(duì)3個(gè)群體30周齡（高峰期）蛋品進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，JL雜交組合30周齡的蛋重輕于JY系和LK系，而300日齡時(shí)3個(gè)群體蛋重?zé)o明顯差異，表明其蛋重隨日齡而逐漸增加，與劉子豪等研究相符[18]。JL雜交組合的蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度分別為 4.62 kg/cm2和 0.46 mm，均高于JY系和LK系，表現(xiàn)為明顯的正向雜種優(yōu)勢(shì)；而蛋殼顏色則深于JY系和LK系，表現(xiàn)為明顯的負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)。蛋殼質(zhì)量對(duì)于禽蛋的孵化和儲(chǔ)存等均有重要影響，蛋殼越厚則強(qiáng)度越高，且一般認(rèn)為蛋殼厚度高于0.35 mm時(shí)，具有良好的運(yùn)輸性和保存性[19]。另有研究表明，蛋殼顏色與蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度呈中低度相關(guān)，殼色越深，家禽沉積色素時(shí)間越長(zhǎng)，且蛋的形成過(guò)程中鈣的沉積能力越強(qiáng)，蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[20]。故JL蛋殼質(zhì)量?jī)?yōu)于JY系和LK系，或與其較深的殼色有關(guān)。蛋黃顏色是一項(xiàng)重要蛋品評(píng)定指標(biāo)，其主要受遺傳和飼料中著色物質(zhì)的影響，消費(fèi)者更加青睞于顏色較深、色澤鮮艷的蛋黃，而蛋黃的色素積累是由蛋黃中類(lèi)胡蘿卜素的沉積量所決定的[21]。本研究中，3個(gè)群體蛋黃顏色深淺依次為L(zhǎng)K＞JY＞JL，且相互間差異顯著（P＜0.05）。3個(gè)群體飼料相同且家禽機(jī)體本身不能直接合成類(lèi)胡蘿卜素，故LK系和JY系腸道吸收色素及色素沉積能力或更強(qiáng)于JL雜交組合。蛋白高度和哈氏單位用以反映雞蛋的新鮮程度，其值越高，則蛋越新鮮，蛋白黏稠度越好[22]。本研究中，在同一時(shí)間進(jìn)行測(cè)量，JL雜交組合的蛋白高度和哈氏單位均低于JY系和LK系，呈現(xiàn)較大的負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)，表明蛋白高度和哈氏單位受遺傳背景影響較大，JL的蛋白黏稠性較低，或?yàn)楫a(chǎn)蛋數(shù)量增加所帶來(lái)的負(fù)面影響。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用綠殼基因顯性純合子的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，獲得了綠殼蛋率接近100%、具有“五黑一綠”的理想外貌特征且生產(chǎn)性能（早期體重、開(kāi)產(chǎn)性能、300日齡產(chǎn)蛋性能、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼顏色等）均優(yōu)于JY系與LK系的雜交組合JL，為綠殼蛋雞純系選育提供了重要的參考信息。