劉 釗，趙仲孟，楊世勇，黃小麗，田 莉，楊 淞，馮 楊，段 靖，杜宗君

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130）

精子是由雄性動(dòng)物產(chǎn)生并傳遞其遺傳物質(zhì)的一種高度分化的細(xì)胞，其主要功能是完成受精，使物種得以延續(xù)，而在不同的物種之間精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異性。其中哺乳動(dòng)物的精子的結(jié)構(gòu)特征基本相同，其整體形態(tài)呈蝌蚪狀，主要由頭部和尾部組成，精子尾部由前向后分為頸段、中段、主段和末端，但是精子的形態(tài)在不同的哺乳動(dòng)物中也有所差異，主要體現(xiàn)在頭部[1]。與哺乳動(dòng)物相比，禽類的精子也可分為頭部和尾部，尾部又分為頸部、中段、主段和末端，但禽類的精子頭部呈鐮刀狀，立體形狀為長(zhǎng)柱狀，頸短尾長(zhǎng)，外形纖細(xì)，不同的禽類精子形態(tài)在種屬之間存在一定的差異[2-3]。魚類的精子形態(tài)與禽類差異較大，與哺乳動(dòng)物更為接近，但結(jié)構(gòu)上存在差異，魚類精子主要分為頭部、中段和尾部3部分，頭部和中段緊密相連，尾部一般為細(xì)長(zhǎng)的鞭毛。與哺乳動(dòng)物一樣，魚類的精子形態(tài)也呈蝌蚪狀，但泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、大口黑鱸（Micropterus salmoides）[5]鲀、綠鰭馬面 （Thamnaconus septentrionalis）[6]等大多數(shù)硬骨魚類不具有頂體結(jié)構(gòu)，而哺乳動(dòng)物的精子具有頂體結(jié)構(gòu)。

在硬骨魚類中，鱘形目魚類作為一種演化兩億多年的古老魚類，其具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值：個(gè)體較大，肉肥嫩多脂，富含蛋白質(zhì)，魚卵經(jīng)加工后制成的魚子醬也是享譽(yù)世界的佳肴。鱘形目魚類能夠演化至今，其成功的繁殖策略是非常關(guān)鍵的，而在繁殖中精子結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。在動(dòng)物的演化過程中，動(dòng)物的受精方式發(fā)生著變化，同時(shí)精子形態(tài)也在發(fā)生一系列的變化。陸生動(dòng)物在適應(yīng)陸生生活與體內(nèi)受精的生殖方式時(shí)，其精子逐漸變長(zhǎng)，另外發(fā)展了其他附屬的尾部細(xì)胞骨骼器官[7]。和大多數(shù)硬骨魚類一樣，鱘形目魚類的精子也是由頭部、中段和尾部3部分組成，但鱘形目魚類精子頭部具有明顯的頂體結(jié)構(gòu)，且中段明顯[8-14]，這些結(jié)構(gòu)特征可能與鱘形目魚類進(jìn)化相關(guān)。

達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）均屬于鱘形目（Acipenseriformes）、鱘科（Acipenseridae）、鱘屬（Acipenser）[15]。達(dá)氏鱘主要分布于長(zhǎng)江流域，作為國家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和長(zhǎng)江上游急切保護(hù)魚類[16]，已成為長(zhǎng)江上游珍稀特有魚類國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的主要保護(hù)對(duì)象之一。西伯利亞鱘則主要分布于額爾齊斯河流域，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，目前作為我國人工養(yǎng)殖鱘魚的主要品種之一，已在全國大面積推廣養(yǎng)殖。達(dá)氏鱘的精子研究目前有關(guān)于其生理生態(tài)[17-18]、結(jié)構(gòu)[19]及保存[20]等方面的報(bào)道，對(duì)西伯利亞鱘精子的研究主要涉及保存方法及環(huán)境因素對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響[21-23]，然而關(guān)于天然棲息水域迥異、珍稀級(jí)別不同的這兩種鱘屬魚類的精子超微結(jié)構(gòu)比較未見報(bào)道。本研究采用透射電鏡對(duì)達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較觀察，以期為鱘類的種質(zhì)資源的保護(hù)與利用及其繁殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子采集時(shí)間為2016年12月，來源于四川潤兆漁業(yè)有限公司（軍樂基地）性腺發(fā)育良好的性成熟雄性親本（達(dá)氏鱘親本年齡9+，體長(zhǎng) 122.2 cm，體重 21.3 kg；西伯利亞鱘親本年齡8+，體長(zhǎng) 125.5 cm，體重 32.2 kg），經(jīng)人工催產(chǎn)后獲得。采集2 mL鱘魚精液，馬上用2.5%的戊二醛固定，裝入樣品箱中并用冰袋降溫，在2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

透射電鏡樣品制備：將固定好的精液經(jīng)15 000 r/min離心30 min后棄去上清液，將精子團(tuán)塊置于2.5%的戊二醛中保存，4℃過夜。樣品經(jīng)PBS緩沖液清洗3次，每次時(shí)間為10 min，然后用1%鋨酸再固定 2 h，用 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，最后環(huán)氧樹脂置換，浸透、包埋。超薄切片后經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，用透射電鏡（日立H-600型，自帶拍照系統(tǒng)）進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 頭部

達(dá)氏鱘精子頭部（圖1A、圖 1C）長(zhǎng)約為 7.15 μm，由頂體和細(xì)胞核組成。頂體長(zhǎng)約0.68 μm。頂體由頂體泡、亞頂體以及顆粒物質(zhì)等組成，呈帽狀覆蓋在精子頂端。頂體泡位于頂體的最外層，亞頂體位于頂體泡與核區(qū)之間，且與兩者結(jié)合緊密，頂體泡與亞頂體中間具頂體膜，且在頂體后外側(cè)存在頂體后外側(cè)延長(zhǎng)物。細(xì)胞核由染色較深的電子致密物組成，核質(zhì)分布均勻，外周質(zhì)膜覆蓋，膜與核結(jié)合緊密，核中無囊泡。細(xì)胞核中有3條核管（內(nèi)切溝）呈螺旋形排列，從細(xì)胞核的橫切面觀察，3條核管之間排列似三角形，3條核管始自植入窩，一直延伸至頂體。

西伯利亞鱘精子頭部（圖1B、圖1D）長(zhǎng)約7.12 μm，與達(dá)氏鱘精子頭部長(zhǎng)度相近，且頭部也分為頂體和細(xì)胞核兩部分。西伯利亞鱘頂體長(zhǎng)約0.83 μm，較達(dá)氏鱘精子頂體長(zhǎng)，西伯利亞鱘精子頂體也包括頂體泡、亞頂體以及顆粒物質(zhì)等，且其精子頂體也存在后側(cè)延長(zhǎng)物。西伯利亞鱘細(xì)胞核也是由電子密度均勻的染色質(zhì)組成，外周包被核膜。但是在西伯利亞鱘精子細(xì)胞核中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)切溝結(jié)構(gòu)。

圖1 達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子頭部對(duì)比Figure 1 A comparison of the sperm head of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.2 中段

達(dá)氏鱘精子中段（圖 2A）長(zhǎng)度約為 1.13 μm，呈楔形沿中軸對(duì)稱，由線粒體、伸入中段的軸絲以及中心粒復(fù)合體等組成。線粒體呈圓形或橢圓形位于細(xì)胞核后端質(zhì)膜和核膜之間，呈環(huán)形單層排列。在中段和細(xì)胞核連接處有向核內(nèi)凹陷的植入窩和纖維體結(jié)構(gòu)。植入窩由膜包被呈囊狀結(jié)構(gòu)，纖維體位于植入窩內(nèi)。植入窩之后是中心粒復(fù)合體，由近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒組成，近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒相互垂直，近端中心粒位于核植入窩正后方，由9組三聯(lián)微管組成。

西伯利亞鱘精子中段（圖2B）長(zhǎng)度約為1.25 μm，相較于達(dá)氏鱘精子中段長(zhǎng)度要長(zhǎng)。西伯利亞鱘精子中段的形狀和結(jié)構(gòu)與達(dá)氏鱘的形狀與結(jié)構(gòu)相仿，形狀呈楔形且沿中軸對(duì)稱，由線粒體、伸入中段的軸絲以及中心粒復(fù)合體等組成，且分布位置相一致。

圖2 達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子中段對(duì)比Figure 2 The midsection of sperm of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.3 尾部

達(dá)氏鱘精子的尾部（圖3A）為一條細(xì)長(zhǎng)的鞭毛，長(zhǎng)約為 39.33 μm，約占全長(zhǎng)的 80.26%，由細(xì)胞質(zhì)膜和軸絲組成。尾部軸絲為典型的“9+2”型雙聯(lián)體微管結(jié)構(gòu)，軸絲的起始端與遠(yuǎn)端中心粒的末端相連，該處微管清晰，但中央微管僅見雛形，隨著軸絲從袖套中的延伸，軸絲與袖套之間出現(xiàn)的腔越來越大。尾部中間為軸，軸兩側(cè)有翼呈扁平形。鞭毛兩側(cè)有側(cè)鰭，側(cè)鰭的基部分布有顆粒狀物質(zhì)。

西伯利亞鱘精子的尾部（圖3B）也為一條細(xì)長(zhǎng)的鞭毛，但其鞭毛長(zhǎng)約 45.23 μm，約占全長(zhǎng)的 84.38%，高于達(dá)氏鱘鞭毛占精子全長(zhǎng)的比值。西伯利亞鱘精子的鞭毛同樣為典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu)，且鞭毛兩側(cè)亦有側(cè)鰭結(jié)構(gòu)。

圖3 達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子鞭毛對(duì)比Figure 3 A comparison diagram of the sperm flagellum of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

3 討論

達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘均屬于鱘形目，兩者在精子結(jié)構(gòu)上與其他種類的鱘形目魚類相似，整體結(jié)構(gòu)呈蝌蚪狀，由頭部、中段和尾部3部分組成，且頭部具有頂體結(jié)構(gòu)，這一特點(diǎn)與其他硬骨魚類差異明顯。在有關(guān)動(dòng)物精子結(jié)構(gòu)的報(bào)道中，哺乳動(dòng)物和禽類的精子頭部均具有明顯的頂體結(jié)構(gòu)[1-3]，而大多數(shù)硬骨魚類的精子頭部無頂體結(jié)構(gòu)，但在鱘類如中華鱘（Acipenser sinensis）的精子頭部前端發(fā)現(xiàn)明顯的傘狀頂體[26]。頂體是位于精子頭部最前端的帽狀結(jié)構(gòu)，相當(dāng)于普通細(xì)胞內(nèi)的溶酶體，內(nèi)含多種酶類。因此可見，頂體結(jié)構(gòu)對(duì)提高受精率有重要作用，鱘形目魚類精子頭部的頂體結(jié)構(gòu)可能是其在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中為了適應(yīng)環(huán)境不斷演化而來，是鱘魚類保持其物種延續(xù)的重要策略。同時(shí)在兩種鱘魚之間的精子頂體結(jié)構(gòu)都存在后外側(cè)延長(zhǎng)物（PLP），與郭威[19]、章龍珍等[21]的研究結(jié)果基本一致。而目前研究對(duì)PLP結(jié)構(gòu)功能還尚未有定論，但有部分學(xué)者認(rèn)為在受精過程中頂體后外側(cè)突出物可以錨定在卵上[27]，因此PLP結(jié)構(gòu)的功能可能與提高受精率相關(guān)。

頂體后緊接著是細(xì)胞核，不同動(dòng)物的細(xì)胞核形狀差異較大。馬鹿（Cervus elaphus）[28]、綿羊（Ovis aries）[29]等有蹄類動(dòng)物的精子細(xì)胞核為扁卵圓形；人（Homo sapiens）[30]、東北虎（Panthera tigris altaica）[31]的精子細(xì)胞核呈犁形；大鼠（Rattus norvegicus）[32]、小鼠（Mus musculus）[33]的精子細(xì)胞核呈鐮刀狀；大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）[34]呈豆瓣?duì)?，鴕鳥（Struthio camelus）[2]、火雞（Meleagris gallopavo）[3]的細(xì)胞核呈長(zhǎng)棒狀結(jié)構(gòu)，而本實(shí)驗(yàn)研究的兩種鱘魚的精子細(xì)胞核呈短棒狀結(jié)構(gòu)，與哺乳動(dòng)物和鳥類都不相同，與泥鰍[4]、大口黑鱸[5]、川陜哲羅鮭（Hucho bleekeri）[24]、齊口裂腹魚（Schizothorax plagiostomus）[25]等大多數(shù)硬骨魚類的精子細(xì)胞核為圓形的特征也不相同[35]，這可能是和鱘魚適應(yīng)環(huán)境相關(guān)。本研究中兩種鱘魚精子細(xì)胞核局部構(gòu)造存在差異，達(dá)氏鱘細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)內(nèi)切溝，這一結(jié)構(gòu)在西伯利亞鱘的精子細(xì)胞核中沒有觀察到，有研究表明內(nèi)切溝可能在受精時(shí)維持精子細(xì)胞核呈錐狀進(jìn)入卵內(nèi)有關(guān)[36]，有利于提高達(dá)氏鱘受精率。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘精子尾部鞭毛相似，兩側(cè)均長(zhǎng)有側(cè)鰭，側(cè)鰭結(jié)構(gòu)并非是種屬間的特異性結(jié)構(gòu)，在其他種類鱘魚[8-14，17]以及其他硬骨魚類[5，24-25]精子超微結(jié)構(gòu)的研究中也發(fā)現(xiàn)側(cè)鰭結(jié)構(gòu)，但在部分魚類[4，6，37-38]的精子尾部鞭毛無側(cè)鰭結(jié)構(gòu)。目前為止，對(duì)于側(cè)鰭的生物學(xué)功能仍不是十分清楚，M.N.Dilauro等[8]認(rèn)為側(cè)鰭是對(duì)體外受精的適應(yīng)，有助于提高精子游動(dòng)速率。但有學(xué)者認(rèn)為鞭毛的鰭狀物與受精環(huán)境并沒有相關(guān)性，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)在許多體內(nèi)受精的魚類鞭毛中也出現(xiàn)了鰭狀結(jié)構(gòu)[39]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)兩種鱘魚精子側(cè)鰭的基部分布著許多小的顆粒狀物質(zhì)，這些顆粒狀物質(zhì)可能與提高精子的運(yùn)動(dòng)速度有關(guān)，有助于提高鱘魚受精率。