楊晉嫻 ，王 新 ，劉 東 ，張海駿 2，，邵義祥

（南通大學(xué)1杏林學(xué)院；2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；3江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇226001）

C型凝集素（C-type lectin）是一類含有Ca2+依賴的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbonhydrate-recognition domain,CRD）的蛋白超家族,包含thrombomodulin（TM）/CD141、endosialin/TEM1/CD248、CD93/C1qRP/AA4等亞家族,均為重要的模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptor,PRR）,參與調(diào)控機(jī)體多個(gè)生物學(xué)過程,包括固有免疫、細(xì)胞間粘附、細(xì)胞凋亡[1-2]。TM是血管內(nèi)皮中發(fā)現(xiàn)的一種抗凝血因子,在小鼠模型中TM功能喪失導(dǎo)致動(dòng)脈和靜脈循環(huán)中自發(fā)的致死性血栓形成[3]；另外,TM的C型凝集素結(jié)構(gòu)域能夠干擾多形核白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的粘附[4],并抵消脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]。Clec14a屬于TM家族成員,是一種單通道跨膜糖蛋白[6-9]。有研究表明,Clec14a是腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物（tumor endothelial markers,TEM）,在腫瘤血管系統(tǒng)中高表達(dá),參與調(diào)控絲狀偽足形成、細(xì)胞遷移和管腔形成[10]。Kim等[11]研究也發(fā)現(xiàn)CLEC14a-CTLD靶向抗體能夠抑制VEGF依賴的血管生成以及腫瘤血管生成。

迄今為止,有關(guān)Clec14a基因的研究主要在腫瘤領(lǐng)域,而關(guān)于該基因?qū)ρ馨l(fā)育的影響鮮見報(bào)道,包括其影響血管發(fā)育的機(jī)制研究。斑馬魚發(fā)育早期胚胎透明可辨,利于活體成像,因此我們首選斑馬魚作為研究血管發(fā)育的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我們通過胚胎整體原位雜交技術(shù),檢測(cè)Clec14a基因在斑馬魚胚胎期的時(shí)空表達(dá),并通過Mo下調(diào)Clec14a基因表達(dá)和注射該基因mRNA進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn),觀察該基因?qū)ρ馨l(fā)育,特別是血管新生（angiogenesis）的影響,進(jìn)一步分析其調(diào)控血管發(fā)育過程的機(jī)制,為后期的臨床研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用AB系斑馬魚和Tg（kdrl:mCherry）、Tg（fli1a:nGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚,喂養(yǎng)及雜交方式嚴(yán)格按照Westerfield編著的《實(shí)驗(yàn)室斑馬魚實(shí)驗(yàn)指南》[12]進(jìn)行,飼養(yǎng)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)化斑馬魚飼育室。

1.2 主要試劑 4%多聚甲醛（PFA）,含Tween-20磷酸鹽緩沖液（PBST）,甲醇,anti-Dig-AP（Roche）,低熔點(diǎn)瓊脂糖（Thermo Fisher Scientific）,1-phenyl-2-thiourea（Sigma）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚胚胎獲?。悍庇张咛デ耙煌韺唏R魚成魚按雌雄比為2:1放入雜交缸,次日早晨亮燈后拔去擋板,交配后收集胚胎,于28.5℃系統(tǒng)水中進(jìn)行培養(yǎng)。分別在24 hpf、36 hpf和48 hpf收集胚胎,然后在4℃條件下,4%多聚甲醛固定過夜,PBST洗脫后甲醇梯度脫水,-20℃存儲(chǔ)備用。

1.3.2 胚胎整體原位雜交：選取存儲(chǔ)不同時(shí)間點(diǎn)的胚胎進(jìn)行復(fù)水處理,經(jīng)PBST多次清洗后使用100 ng/mL蛋白酶K消化處理,然后加入Clec14am-RNA探針雜交過夜。第二天,通過檸檬酸鈉緩沖液（SSC）梯度洗去未結(jié)合的探針,然后經(jīng)anti-Dig-AP(Roche)抗體過夜處理。第三天,使用PBST溶液洗去未結(jié)合的anti-Dig-AP抗體,加入BCIP/NBT/NTMT顯色,最后將染色的胚胎保存于甘油中拍照觀察。用于合成Clec14a基因原位雜交探針的PCR上游引物：5’-CGGCTCCTACATTTGTGACG-3’；下游引物：5’-CCACATCAGCAGAAAGACCC-3’。

1.3.3 體外合成Clec14amRNA：根據(jù)Clec14a序列信息,設(shè)計(jì)引物,通過RT-PCR技術(shù)體外擴(kuò)增Clec14amRNA,然后將PCR產(chǎn)物連接到pCS2+載體上,篩選出重組質(zhì)粒。通過KpnI內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒,并以其為模板體外合成Clec14a mRNA（mMessagemMachineRSP6 kit,Ambion）。在斑馬魚胚胎1～2細(xì)胞時(shí)期顯微注射Clec14a mRNA0.3ng。通過在線的引物設(shè)計(jì)軟件primer3（http://primer3.ut.ee）設(shè)計(jì)合成Clec14a（NM_199786）的PCR引物。上游引物為：5’-CGGGATCCCGTGGTAGAAAGGGCTGTAGAGGG-3’； 下 游 引 物 為 ：5’-GGAATTCCGGCAAGATGTGAGCATTGAGGT-3’。

1.3.4 顯微注射：根據(jù)Clec14a序列信息設(shè)計(jì)合成特異性 morpholino（GENETOOLS,LLC）[13]下調(diào)Clec14a基因表達(dá)。在斑馬魚1細(xì)胞期顯微注射Clec14a-Mo3ng,抑制Clec14a基因表達(dá),并在28.5℃條件下培養(yǎng)。用于下調(diào)Clec14a的morpholino序列為：5’-GTAATACCATCCAGAAATCCATGTC-3’。

1.3.5 顯微成像：將轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（kdrl:mCherry）和 Tg（fli1a:nGFP）胚胎麻醉（tricaine,Sigma)后,包埋在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖（UltraPureTMLow Melting Point Agarose,Thermo Fisher Scientiic）中,凝固后通過Leica SP8（Leica Microsystems）激光共聚焦顯微境拍攝,分析斑馬魚胚胎期血管發(fā)育情況,圖像使用BitplaneImaris 7.2.3處理。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR分析：利用Trizol（Invitrogen）提取不同時(shí)間段斑馬魚胚胎總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit,Roche）,再采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Clec14a的表達(dá)。PCR正向引物：5’-TATGACAAGCCAGGAGAGATGCC-3’；反向引物：3’-GCGAAGATGTGTAGTTCAGGACC-5’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有試驗(yàn)重復(fù)3次以上,樣本量n＞10,采用GraphPad Prism 7分析軟件處理分析數(shù)據(jù),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Clec14a基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期表達(dá) 利用胚胎整體原位雜交技術(shù)在mRNA水平檢測(cè)Clec14a的時(shí)空表達(dá),結(jié)果表明：在 24 hpf、48 hpf及72 hpf斑馬魚胚胎中,節(jié)間血管（ISV）、后主靜脈（PCV）以及背主動(dòng)脈（DA）均有Clec14a基因表達(dá),并且48 hpf后心臟及大腦血管也有明顯信號(hào),72 hpf時(shí)斑馬魚胚胎心臟中Clec14a的表達(dá)更為明顯,但是在胚胎后期ISV中,該基因的表達(dá)強(qiáng)度變?nèi)?主要集中在心臟部位（圖1）。

圖1 整體原位雜交檢測(cè)Clec14a在斑馬魚血管系統(tǒng)中的表達(dá)

2.2 Clec14a基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致斑馬魚胚胎ISV發(fā)育缺陷 通過顯微注射方法向轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（kdrl:mCherry）1細(xì)胞時(shí)期的胚胎中注射特異性morpholino（Clec14a-Mo）,然后繼續(xù)培養(yǎng)至 30 hpf和48 hpf,每組分別取15條斑馬魚,每條斑馬魚統(tǒng)計(jì)5條血管,激光共聚焦顯微成像分析ISV形態(tài)。結(jié)果表明：30hpf時(shí),空白對(duì)照組斑馬魚胚胎的ISV已全部長(zhǎng)至DLAV,而Clec14a-Mo組只有極少數(shù)ISV生長(zhǎng)至DLAV,且ISV血管腔明顯；待胚胎培養(yǎng)至48 hpf時(shí),Clec14a-Mo組有一部分ISV長(zhǎng)至DLAV,但I(xiàn)SV管腔仍然較細(xì)（圖2A）。根據(jù)激光共聚焦成像分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2B所示,提示Clec14a基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致斑馬魚胚胎ISV發(fā)育缺陷。

圖2 激光共聚焦顯微成像觀察下調(diào)Clec14a基因表達(dá)后斑馬魚節(jié)間血管發(fā)育

2.3 Clec14a基因表達(dá)下調(diào)抑制斑馬魚ISV內(nèi)皮細(xì)胞增殖 為了進(jìn)一步研究Clec14a基因在斑馬魚血管發(fā)育過程對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響,我們使用標(biāo)記斑馬魚內(nèi)皮細(xì)胞核的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1a:nGFP）進(jìn)行實(shí)驗(yàn),從而研究下調(diào)Clec14a基因影響斑馬魚血管發(fā)育的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。向轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(kdrl:mCherry)1細(xì)胞時(shí)期的胚胎中注射Clec14a-Mo,繼續(xù)培養(yǎng)至30 hpf和48hpf時(shí),每組分別取15條斑馬魚,每條斑馬魚統(tǒng)計(jì)5條血管,利用激光共聚焦顯微成像分析統(tǒng)計(jì)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明：在30hpf時(shí),對(duì)照組斑馬魚胚胎已有65.33%ISV分化為3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞,而Clec14a-Mo組分化為3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞僅有14.67%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。待斑馬魚胚胎發(fā)育至48hpf時(shí),對(duì)照組78.66%ISV內(nèi)皮細(xì)胞分化至5個(gè)及5個(gè)以上,而Clec14a-Mo組未見有ISV內(nèi)皮細(xì)胞增殖至6個(gè),分化至5個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的ISV數(shù)量?jī)H占10.67%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C）。從圖3A可以發(fā)現(xiàn),ISV中頂細(xì)胞（tip cell）的遷移也受到較大影響,Clec14a-Mo組的頂細(xì)胞很難到達(dá)DLAV（圖 3D）。

2.4 Clec14a基因下調(diào)后mRNA表達(dá)增加 為了探究注射morpholino對(duì)斑馬魚Clec14a基因的敲降效率,我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和morpholino注射組Clec14a表達(dá)水平,結(jié)果顯示：在30 hpf注射組Clec14a基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 4）。

2.5 注射Clec14a基因mRNA確定Clec14a-Mo的特異性 為了確認(rèn)Clec14a基因下調(diào)導(dǎo)致斑馬魚胚胎ISV發(fā)育缺陷的特異性,我們?cè)隗w外合成Clec14amRNA,在轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（kdrl:mCherry）1細(xì)胞時(shí)期,向胚胎中單獨(dú)注射Clec14a-Mo或同時(shí)注射Clec14a-Mo和Clec14amRNA,分別培養(yǎng)至30 hpf,利用激光共聚焦進(jìn)行ISV形態(tài)分析。結(jié)果表明：在30 hpf時(shí),Clec14a-Mo組6.67%ISV生長(zhǎng)至DLAV,78.67%ISV到達(dá)橫向肌隔位置。而在挽救組60.00%ISV生長(zhǎng)至DLAV,29.33%ISV到達(dá)橫向肌隔位置（圖5A）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示ISV發(fā)育缺陷能夠被Clec14a-mRNA部分拯救（圖5B）,提示Clec14a-Mo具有較強(qiáng)的特異性,而Clec14a-mRNA能夠在一定程度上矯正血管發(fā)育缺陷。

圖3 下調(diào)Clec14a基因表達(dá)后斑馬魚節(jié)間血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目和遷移情況

圖4 對(duì)照組與注射Clec14a-Mo斑馬魚胚胎體內(nèi)Clec14a基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR分析

圖5 注射Clec14a-mRNA后斑馬魚節(jié)間血管發(fā)育的激光共聚焦顯微成像分析

3 討 論

凝血蛋白（TM）家族屬于C型凝集素超家族,其中包括TM、endosialin、CD93和Clec14a[1]。雖然這些蛋白質(zhì)參與血管發(fā)生,但是它們的表達(dá)不限于內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）。TM作為最初在內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的抗凝因子,不僅在脈管系統(tǒng)中表達(dá),也在腦膜、間皮細(xì)胞、真皮角質(zhì)細(xì)胞和血小板中表達(dá)。CD93是一種吞噬作用的受體,在髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[14-15]。Endosialin/TEM1是有選擇性地在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[16],因此可以利用進(jìn)行針對(duì)性的治療。Clec14a作為TM家族的新成員,其作用機(jī)制還未見報(bào)道。本研究中原位雜交結(jié)果證實(shí)Clec14a基因在斑馬魚胚胎期的心臟、血管及腦中均有表達(dá)。

在生命科學(xué)研究中,心血管系統(tǒng)是最重要的研究方向之一,它是完成體內(nèi)物質(zhì)交換的基礎(chǔ),是生命代謝活動(dòng)的基本條件,它遍布全身,影響生命體的每一個(gè)重要環(huán)節(jié)。血管發(fā)育過程依賴兩個(gè)階段,一個(gè)是血管發(fā)生（vasculogenesis）,另一個(gè)是血管新生（angiogenesis）[10]。斑馬魚依靠其得天獨(dú)厚的特點(diǎn),成為研究血管新生的首選模型。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（kdrl:mCherry）與 Tg（fli1a:nGFP）分別標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核,我們利用這兩種轉(zhuǎn)基因斑馬魚探討Clec14a基因在血管發(fā)育過程中的作用。在斑馬魚胚胎期,下調(diào)Clec14a基因表達(dá)后,30 hpf和48 hpf均可發(fā)現(xiàn)ISV內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目減少,部分ISV不能生長(zhǎng)至DLAV。同時(shí)我們利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)敲降Clec14a基因的效率進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在注入Clec14a-Mo的斑馬魚胚胎中表達(dá)高于空白對(duì)照組,說明在敲降組斑馬魚中,該基因的翻譯過程受到阻礙,從而產(chǎn)生反饋導(dǎo)致更多的RNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生,最終導(dǎo)致較少的Clec14a蛋白參與血管的發(fā)生發(fā)育,提示Clec14a基因在斑馬魚胚胎期可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞分化和遷移來(lái)影響血管發(fā)育。通過體外合成Clec14amRNA挽救Clec14a-Mo處理后斑馬魚胚胎的表型,挽救后斑馬魚胚胎血管發(fā)育較Clec14a-Mo組有明顯改善,表明Clec14a-mRNA在發(fā)育過程中及時(shí)彌補(bǔ)Clec14a下調(diào)后的缺失,提示注射Clec14a-Mo所導(dǎo)致的斑馬魚血管發(fā)育的影響具有特異性。在研究血管管腔的形成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)中,敲降Clec14a基因我們發(fā)現(xiàn)Clec14a基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成有重要作用,并且參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用,解釋了Clec14a基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞遷移的影響[17]。

綜上所述,本研究顯示,Clec14a基因在斑馬魚胚胎血管的發(fā)育過程中,通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖和遷移,從而影響血管發(fā)育。Clec14a基因調(diào)控中涉及的更深層次的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。本研究為進(jìn)一步探討Clec14a基因在人類血管發(fā)育和相關(guān)疾病的臨床研究中的作用提供了參考依據(jù)。