劉 姣，云春美，金朝仙，李美玲，楊 鴻，倪廣惠

(云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNAs)是一組長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，不參與蛋白質(zhì)或多肽的編碼[1].目前，對于LncRNAs的認(rèn)識尚處于初級階段，LncRNAs與藥物具有關(guān)聯(lián)[2]，一些LncRNAs在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)出現(xiàn)異常，如MALAT1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)[3]在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，MALAT1缺失小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移減少；NEAT1(Nuclear enriched abundant transcript 1)對于人類的非小細(xì)胞肺癌的增殖、惡化[4]和發(fā)病機(jī)制[5]中起重要作用.

燈盞乙素是云南特色民族藥燈盞細(xì)辛Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand -Mazz的主要有效活性成分，在臨床上用于治療心血管疾病.越來越多研究發(fā)現(xiàn)燈盞乙素具有潛在的治療腫瘤的作用[6-7]，其作用機(jī)制尚不明確，目前未有燈盞乙素對腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs的影響的研究.通過研究燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的lncRNAs的表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡述燈盞乙素對腫瘤細(xì)胞的分子作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

燈盞乙素(純度>98%，云南紅河千山生物工程有限公司，批號：20150216)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；CellTiter 96?Aqueous細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)；胎牛血清(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；RNAiso試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(瑞士Roche公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所.腫瘤細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素.細(xì)胞于37℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng).

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1000個(gè)細(xì)胞一共加入培養(yǎng)基100 μL，置CO2培養(yǎng)箱37℃中孵育24 h充分貼壁以后，每孔加入25 μL的含有燈盞乙素的培養(yǎng)基使其終濃度為1、10、25、50、100 μmol/L，其中第3天時(shí)候換液，最終燈盞乙素作用于細(xì)胞一共5 d.測定時(shí)每孔加入CellTiter 96?Aqueous細(xì)胞增殖檢測試劑25 μL，再在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h.Bio-Rad680型酶標(biāo)儀490 nm測吸光度.每組設(shè)6復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次.

1.4 實(shí)時(shí)PCR分析

取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板，每孔7.5×104個(gè)細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱37℃中孵育，接種24 h后加入燈盞乙素.用藥組受試物溶液終濃度分別為1、10、25、50、100 μmol/L.對照組加入等量PBS溶液；每組設(shè)3復(fù)孔，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中.每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次.

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，使用RNAiso試劑盒(Takara)，按照說明書對細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取.利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA(1～2 mg)進(jìn)行cDNA合成，使用羅氏FastStart Essential DNA Green Master和羅氏LightCycler 96?進(jìn)行熒光定量檢測，PCR引物如表1所示.用β-actin作為對照.條件為1、95℃ 120 s，2、95℃ 10 s，3、60℃ 10 s，4、72℃ 10 s，2～4步驟一共45個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)量，2-ΔΔCt的計(jì)算方法ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參，-ΔΔCt=-(ΔCt處理-ΔCt對照).

表1 PCR引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對照組和處理組采用t檢驗(yàn)或方差分析.以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

將乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞置于96孔板中，用不同濃度的燈盞乙素處理5 d.如圖1所示,燈盞乙素低濃度(1、10和25 μmol/L)時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞增殖.10 μmol/L時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng).相反，在50和100 μmol/L的高濃度時(shí)，燈盞乙素則會(huì)抑制細(xì)胞增殖.隨著劑量上升，燈盞乙素對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在10 μmol/L以下是逐漸增強(qiáng)，而超過 10 μmol/L 時(shí)則減小.當(dāng)濃度在50 μmol/L以上時(shí)，則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?

2.2 燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中LncRNA的影響

檢測了LncRNAs中MALAT1、NEAT1基因表達(dá)的變化.MALAT1(圖2A)和NEAT1(圖2B)的基因表達(dá)水平在1、10、25和50 μmol/L顯著低于對照組(p<0.05)，而在100 μmol/L時(shí)顯著高于對照組(p<0.05).

在1 μmol/L～25 μmol/L時(shí)，MALAT1、NEAT1的基因表達(dá)隨著劑量的增加而逐漸下調(diào).相反，在100 μmol/L時(shí)，2種lncRNAs的基因表達(dá)上調(diào).

此外，還測了在不同濃度燈盞乙素處理以后的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中p53基因的mRNA表達(dá)(圖2C).p53基因的mRNA表達(dá)在50 μmol/L及其以下是顯著下調(diào)(p<0.05)，而在100 μmol/L濃度下顯著上調(diào)(p<0.05).

3 討論

文獻(xiàn)[8]研究表明燈盞乙素在小于10 μmol/L的劑量下不會(huì)誘導(dǎo)NaMalwa細(xì)胞凋亡，在15 μmol/L或以上時(shí)會(huì)誘導(dǎo)其凋亡.本研究顯示燈盞乙素在10 μmol/L時(shí)(圖1)對細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用.當(dāng)劑量小于10 μmol/L時(shí)，促進(jìn)作用增強(qiáng).在50 μmol/L以上時(shí)，促進(jìn)作用轉(zhuǎn)化為抑制作用.燈盞乙素在100 μmol/L劑量時(shí)對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用.

燈盞乙素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并伴隨著基因和蛋白的表達(dá)發(fā)生改變.本研究結(jié)果表明燈盞乙素對MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用，其結(jié)果與增殖作用類似，MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)水平在低劑量時(shí)下調(diào)，而在100 μmol/L高劑量時(shí)顯著上調(diào).

Li等[9]的研究表明，燈盞乙素降低了人體腫瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達(dá).Han等[10]的研究顯示了MALAT1的過度表達(dá)明顯降低了MMP-2的表達(dá)水平.本研究證明了燈盞乙素在100 μmol/L時(shí)，明顯上調(diào)了MALAT1的表達(dá)水平(圖2A).同時(shí)，燈盞乙素在100μmol/L時(shí)，通過上調(diào)MALAT1的表達(dá)水平來降低MMP-2的表達(dá)水平，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖.燈盞乙素是如何調(diào)節(jié)LncRNAs的表達(dá)有待進(jìn)一步研究.

燈盞乙素在100 μmol/L時(shí)顯著上調(diào)了p53基因的mRNA表達(dá)(圖2C).據(jù)報(bào)道，燈盞乙素在100 μmol/L時(shí)通過調(diào)節(jié)p53的基因表達(dá)，從而增強(qiáng)了caspase-6蛋白的活性[11].

綜上所述，本研究顯示燈盞乙素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中的LncRNAs MALAT1,NEAT1和p53基因的表達(dá)均產(chǎn)生影響，為進(jìn)一步深入探索LncRNAs的作用機(jī)制提供了依據(jù)，并且有助于從分子水平闡明燈盞乙素對腫瘤的作用機(jī)制.