楊美蓮，樊志峰，蔡圣寶，曹建新，程桂廣，趙天瑞

(昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

桑葚是?？坡淙~喬木桑樹(MorusalbaLinn)的果實，在大多數國家均有紅桑(Morusrubra)、黑桑(Morusnigra)和白桑(Morusalba)，由于其味道鮮美，色澤悅目，熱量低和營養(yǎng)高[1]，通常加工成果酒、果汁和果醬[2].桑葚中富含氨基酸、脂肪酸、礦物質、多酚和多糖等生物活性物質[3]，常用于退燒，治療喉嚨痛，肝腎保護，改善視力和降低血壓等[4].桑葚藥理研究發(fā)現果實提取物具有神經保護、抗氧化、抗肥胖作用、預防心血管疾病、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成、免疫調節(jié)和抗腫瘤活性等生物活性[5-7].

花青素是桑葚中主要的多酚，含量高于藍莓、黑莓、黑加侖和紅醋栗[8].花青素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-蕓香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷和天竺葵素3-O-蕓香苷是桑葚中的主要花青素[9].花青素不僅是是桑葚顏色的主要來源，同時也是其促進健康的關鍵成分[10].丁樂等[11]研究發(fā)現桑葚花色苷粗提物高中劑量組能降低心肌線粒體中MDA含量，升高心肌線粒體中SOD量，較低劑量組和正常組具有顯著性差異(P<0.05)，對小鼠常壓缺氧和心肌缺血實驗具有保護作用.裴蕾等[12]研究發(fā)現桑葚花色苷提取物可以改善由高脂酒精膳食所引起的小鼠棕色脂肪組織的形態(tài)學改變和功能抑制，可防治慢性代謝性疾病.

近年來，人們開展了許多對桑葚活性成分及藥理作用的相關研究，為桑葚資源的高效利用和相關功能性生物制品的研制開發(fā)以及桑葚功能食品的開發(fā)利用奠定了一定的基礎.本研究探討了桑葚花色苷的最佳提取工藝條件，并評價其純化前后的抗氧化能力，為得到更多的桑葚花色苷資源提供有利的參考.

1 材料儀器和方法

1.1 材料和儀器

桑葚樣品2017年2月購自于四川成都，經冷凍干燥后打粉過0.216 mm篩備用.

甲醇、乙醇、丙酮、乙腈：天津市津東天正精細化學試劑廠；碳酸鈉：四川西隴化工有限公司；TPTZ、DPPH、ABTS、福林酚試劑、沒食子酸標準品(分析純)購于Sigma-Aldrich 公司；大孔吸附樹脂：AB-8、NKA-9、NKA-2、HPD-100、XAD-16、HPD-750購于北京索萊寶生物科技有限公司，LSD-296、LSD-762購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；蒸餾水(自備).

電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；AS10200BT型超聲波清洗儀：天津市奧特賽恩斯儀器有限公司；TGL20B型高速旋轉離心機：上海安亭科學儀器廠；旋轉蒸發(fā)器：上海愛郎儀器有限公司；UV-5100BPC型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；pH計：上海闊思電子有限公司.

1.2 方法

1.2.1 花色苷的提取

準確稱取1 g桑葚粉末加入不同的酸化有機溶劑(有機溶劑調節(jié)pH至酸性，以減少花色苷的分解)，在不同條件下進行超聲輔助提取桑葚花色苷.用離心機以10 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮成浸膏，稱重，待用.

1.2.2 花色苷含量的測定

采用pH示差法對桑葚花色苷含量進行測定[9, 13].

pH=1.0的緩沖溶液制備：準確稱取1.117 5 g KCl粉末用蒸餾水定容500 mL,用1 mol/L的HCl溶液調節(jié)至pH=1.0.

pH=4.5的緩沖溶液制備：準確稱取5.4 g乙酸鈉粉末，用蒸餾水定容至100 mL，用乙酸溶液調節(jié)至pH=4.5.

取0.5 g樣品浸膏加一定溶劑稀釋成待測樣液，取1 mL待測溶液加到9 mL pH 1.0的緩沖液中，分別于520和700 nm處測定吸光值.另取1 mL待測液加到pH 4.5的緩沖液中，分別于520和700 nm處測定吸光值.根據如下公式(1)計算出花色苷含量.

桑葚樣品中花色苷含量為：C(mg/L)=A×MW×DF×1000/(ε×l).

(1)

其中A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5,(A510-A700)pH 1.0為加pH 1.0緩沖液的樣液在510和700 nm波長下的吸光值之差；(A510-A700)pH 4.5為加pH 4.5緩沖液的樣液在510和700 nm波長下的吸光值之差；MW=449.2(矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，mg/mol)；DF=樣液稀釋的倍數；ε=26 900(矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，mol-1)；l=比色皿的光路直徑，為1 cm.

1.2.3 桑葚花色苷提取工藝的優(yōu)化

1)單因素試驗.分別考察溶劑種類(水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮)，pH值(pH=1、2 、3 、4 、5)；甲醇體積分數(50%、60%、70%、80%)；料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL))；提取時間(30、60、90 min)；提取次數(1、2、3)對桑葚花色苷提取率的影響.

2)正交試驗.在單因素試驗結果基礎上，通過正交試驗設計L9(33)對桑葚花色苷提取條件進行進一步優(yōu)化，設置3因素(甲醇體積分數A、料液比B和提取時間C)，每個因素設3個水平，重復3次，具體見表1.

表1 正交實驗因素水平表

1.2.4 大孔樹脂篩選

參考文獻[14-15]，大孔樹脂用無水乙醇進行洗滌，并不斷攪拌，以除去氣泡，充分溶脹，靜置24 h后，用蒸餾水清洗到無醇味待用.

1)桑葚粗提液的制備.利用正交實驗最佳提取工藝條件對桑葚花色苷進行提取，即稱取一定量的桑葚粉末，在pH=1.0的條件下，用70%甲醇，料液比1∶55(g/mL)，超聲提取60 min，得到桑葚花色苷的粗提液.

2)靜態(tài)吸附與解析.準確量取經預處理過的大孔樹脂2.000 g，置于三角瓶中，準確加入一定體積的粗提液，室溫下中速振蕩24 h，至吸附平衡.將吸附平衡的樹脂置于具塞三角瓶中，準確加入一定體積的70%乙醇溶液，室溫下中速振蕩24 h，然后將樹脂濾出，分別測定兩者洗脫液中桑葚多酚及花色苷的濃度.按(2)式計算吸附量、吸附率和解吸率：

Q=(C0-C1)V1/W,A=[(C0-1)/C0]×100%,D=[(C0-1)V1/C2V2]×100%.

(2)

式中：Q為吸附量(mg/g)，C0為起始濃度(mg/mL)，C1為平衡濃度(mg/mL)，V1為吸附液體積(mL)，W為樹脂重量(g)，A為吸附率(5%)，D為解吸率，C2為洗脫液濃度(mg/mL)，V2為洗脫液體積.

1.2.5 抗氧化能力的測定

1)DPPH·清除能力的測定.參照文獻[16-17]，略作改動.取0.5 mL不同濃度的純化前后樣品溶液和2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合，搖勻，避光反應30 min后，以無水乙醇為空白，于517 nm波長處測吸光度.以對DPPH·的清除率達50%時(IC50，mg/mL)所需要的樣品質量濃度來比較不同溶劑提取液對DPPH·清除能力的大小.DPPH·清除率按公式(3)計算.

(3)

其中：T0空白對照組吸光值(0.5 mL甲醇 + 2.0 mL DPPH工作液);Tx0樣品對照組吸光值(0.5 mL樣品 + 2.0 mL甲醇);Tx樣品吸光值(0.5 mL樣品 + 2.0 mL DPPH工作液).

2)ABTS+·清除能力的測定.參照文獻[18-19]，略作改動.將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 40 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，置于暗處反應12 h，得到ABTS+·儲備液，用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋使其在734 nm波長條件下的吸光度為0.70±0.02.將0.5 mL不同濃度的純化前后桑葚花色苷提取物溶液與4 mL ABTS+·溶液中均勻混合，水浴6 min后，于734 nm波長處測其吸光值.按如下公式(4)進行計算.

(4)

其中：X0空白對照組吸光值(：0.5 mL乙醇+ 4.0 mL ABTS工作液);X1樣品對照組吸光值(：0.5 mL樣品+ 4.0 mL乙醇);X2樣品吸光值(：0.5 mL樣品+ 4.0 mL ABTS工作液).

3)鐵離子還原力的測定.參照文獻[19-20]，略作改動.取0.5 mL稀釋成不同濃度梯度的純化前后的樣品于5 mL離心管中，加入4.5 mL預熱的FRAP溶液(將300 mmol/L pH 3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例混合，30 ℃水浴10 min備用)，充分混勻后，30℃水浴10 min，在593 nm處測定吸光值(用0.5 mL甲醇進行調零).

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

每組實驗均重復3 次，結果表示為均值±方差，采用Origin 8.5繪圖軟件繪圖，SPSS 17.0對數據進行統(tǒng)計學分析，并進行Duncans差異分析，P<0.05表示差異顯著.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖a所示，用70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮以及水按1∶30(g/mL)的料液比分別在同一條件下提取30 min后，按照1.2.2的方法測定花色苷提取率.結果顯示提取效果由好到差依次是70%甲醇>水>70%乙醇>70%丙酮.故選擇提取溶劑為70%甲醇.

圖b所示，用50%、60%、70%、80%、90%甲醇按1∶30(g/mL)料液比在相同條件下提取30 min，計算得桑葚花色苷提取率，結果顯示當甲醇體積分數從50%上升到70%時，花色苷提取率逐漸增大，當甲醇體積分數大于70%時，提取效率略微下降，這可能與花色苷極性大小有關系.因此選擇最適提取溶劑為70%甲醇.

圖c所示，用70%甲醇按料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)在同一條件下進行提取，結果顯示隨著料液比的增加，花色苷提取率在不斷增大，當料液比達到1∶60時，提取率達到最大值，再增加料液比時，花色苷提取率降低.因此從提取效果和經濟條件綜合考慮，最適料液比為1∶60(g/mL).

圖d所示，同時用70%甲醇按料液比1∶60(g/mL)在同一條件下分別超聲提取30、60、90 min，結果顯示超聲時間在30～60 min內，多酚提取率逐漸增大，但超過60 min后多酚提取率略有降低，可能因為提取時間過長導致溫度升高，破壞了花色苷的分子結構，從而引起花色苷得率下降[21].因此，最適超聲時間為60 min.

圖e所示，分別用pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0的70%甲醇下，以料液比為1∶60(g/mL)進行超聲提取60 min得到的桑葚花色苷提取率.結果顯示，在pH=1.0的條件下桑葚花色苷提取率達到最大值，而pH逐漸增大提取率呈現減小性的波動.可能的原因是花色苷本身不穩(wěn)定，在一般條件下極易分解，因此最適pH宜選pH=1.0.

2.2 正交實驗結果

正交試驗設計及結果見下表2，方差分析見表3.

表2 花色苷正交試驗設計L9(33)結果直觀分析

表3 正交試驗方差分析

注：查表得F0.05(2,4)=4.46，F0.01(2,4)=8.65; 當F比>F0.01時，有極顯著差異，用**表示；當F比>F0.05時，有顯著性差異，用*表示.

由極差結果分析可知RB>RC>RA，因此影響桑葚花色苷提取率的主次因素為料液比>提取時間>甲醇體積分數.各因素對于提取效率來說沒有顯著性差異，綜合指標最優(yōu)組合是A2B1C2，即在固定超聲波的條件下，桑葚花色苷最佳提取工藝條件為70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取時間60 min，該條件下桑葚多酚提取率為6.497%.

2.3 大孔樹脂純化

花色苷吸附量與樹脂極性、樹脂比表面積有關.大孔樹脂對桑葚花色苷的吸附不僅是利用多孔網狀結構及高比表面積形成的分子篩作用，而且與樹脂和花色苷物質之間的范德華力或氫鍵有關，樹脂的孔徑對花色苷的吸附效果影響較大，孔徑過小或過大都不利于花色苷分子的保留[22].由以上數據可知，NKA-2型大孔樹脂有最好的吸附能力，其次依次為LSD-296>NKA-9>HPD-750>HPD-400，而AB-8型樹脂對樣品的吸附作用不強，吸附率僅為35.61%，而從吸附樣品的解析情況，其解析率大小依次為AB-8>HPD-400>NKA-9>HPD-750>NKA-2> LSD-296.綜合考慮吸附和解吸效率兩個指標，選取各項指標相對較高的NKA-9型大孔樹脂純化桑葚花色苷.

純化前桑葚花色苷的含量為6.49 mg/g，純化后樣品的花色苷含量達到10.38 mg/g，說明NKA-9型樹脂純化桑葚花色苷工藝效果較為明顯，有一定的實用性，具體結果如下圖所示.

2.4 純化前后抗氧化結果

桑葚花色苷純化對Fe3+還原力、DPPH·和ABTS+·的清除活性情況如下表4所示.

抗氧化活性的測定具有多種機制，如清除活性氧、抑制脂質氧化等，同一種樣品中會有多種抗氧化物質同時存在，在一定程度上會出現協同抗氧化作用.抗氧化活性受多種因素影響，因此，對于同一個樣品，應采用3種及其以上抗氧化方法綜合評價抗氧化活性[23].本文采用DPPH·、ABTS+·的清除能力以及對Fe3+還原能力的測定3種方法來評價桑葚花色苷純化前后抗氧化活性的變化情況.

表4 粗提物和純化后桑葚花色苷提取物對Fe3+還原力、DPPH·和ABTS+·的半抑制質量濃度

結果以IC50值來表示.IC50越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強[24].由表4可知，桑葚花色苷具有一定的抗氧化能力，且經大孔樹脂純化后的花色苷由于除去對自由基沒有清除作用的糖類、蛋白質和部分有機物使得抗氧化能力明顯高于純化前桑葚花色苷，純化前花色苷對于Fe3+還原能力、DPPH+·、ABTS+·自由基的IC50分別為0.825、0.318、0.817 mg/mL，而純化后桑葚花色苷對于Fe3+還原能力IC50值為0.126 mg/mL，比純化前提高了6.55倍，DPPH+·自由基清除能力提高了1.94倍，而ABTS+·自由基相對于純化前提高了3.54倍.但相對于抗壞血酸(IC50值分別為0.012、0.012、0.018 mg/mL)來說，桑葚花色苷的抗氧化性能略遜，但作為一種天然抗氧化劑，桑葚提取物均具有良好的自由基清除活性，可作為良好的抗氧化劑來源.

3 結語

本研究采用正交試驗考察提取溶劑體積分數、料液比以及時間對桑葚花色苷提取率的影響，確定其最佳提取工藝參數為70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取時間60 min，該條件下桑葚花色苷提取率為6.497%.通過6中不同極性大孔樹脂吸附和解析效率比較，確定NKA-9 型樹脂為桑葚花色苷的最佳純化樹脂.綜合DPPH+·、ABTS+·自由基清除活性以及FRAP法對桑葚花色苷提取物的抗氧化活性進行評價，發(fā)現其抗氧化活性明顯，可作為良好的天然抗氧化劑來源.為桑葚作為天然抗氧化劑的提取和開發(fā)利用提供理論基礎.