蒲 艷，田輝伍，陳大慶，段辛斌，劉紹平，汪登強

(1.西南大學生命科學學院，重慶 400715；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，武漢 430223)

圓筒吻鮈(Rhinogobiocylindricus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鮈亞科(Gobioninae)吻鮈屬(Rhinogobio)，主要分布在長江上游干流及其支流(如岷江、金沙江、嘉陵江等)[1-2]，近年有研究表明在長江中游也有分布[3]，是長江主要經(jīng)濟魚類[4]。圓筒吻鮈喜生活于流水或緩流水環(huán)境，有洄游產(chǎn)卵行為[5]，主要以底棲生物(如搖蚊幼蟲)為食[6]。資源調查表明，目前長江上游圓筒吻鮈資源開發(fā)率偏高，存在過度開發(fā)現(xiàn)象，資源量呈下降趨勢[9]。圓筒吻鮈產(chǎn)漂流性魚卵，受精卵隨江水漂流發(fā)育，長江干流水利工程建設改變了河流自然水文狀況、流水江段長度變短、阻隔了魚類的洄游通道[4]，嚴重影響了其種質資源，大壩建設對圓筒吻鮈繁殖習性同樣產(chǎn)生嚴重影響，進一步威脅其生存。迄今，有關圓筒吻鮈研究報道主要在生物學[4]、物種分化[7]、組織學[8]、資源量[9]等方面，在遺傳學方面，曾曉蕓對其遺傳結構分析也有了初步研究[10]，其研究區(qū)域為長江上游宜賓至萬州庫區(qū)江段以及主要支流，屬于長江上游及其支流，而長江中游卻未見相關報道。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因結構簡單、呈母系遺傳、拷貝數(shù)量大、進化速率快、無組織特異性等特點，被廣泛運用于物種分化、群體遺傳多樣性[10，19]、種屬親緣關系遠近等研究中[11]。細胞色素b(Cytb)基因的結構和功能在mtDNA 13個蛋白質編碼基因中了解的最為全面，且其進化速度適中、轉換或顛換占很大比例等特點，被認為是研究種內(nèi)或近緣中間系統(tǒng)發(fā)育、種質資源狀況和群體遺傳結構的理想工具，成為魚類遺傳多樣性研究中常見的分子標記[14，26，27]。本實驗采用線粒體Cytb序列分析長江中上游圓筒吻鮈群體的遺傳多樣性及種群結構，以闡明其遺傳多樣性和群體分化狀況，為圓筒吻鮈種質資源開發(fā)和保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年7～10月在長江上游干流的宜賓(YB)、瀘州(LZ)、合江(HJ)、江津(JJ)、巴南(BN)、涪陵(FL)及長江中游的黃岡(HG)7個采樣點共采集圓筒吻鮈140尾(表1)，各采樣點位置見圖1。所有樣本根據(jù)其形態(tài)鑒定后剪取鰭條，保存于無水乙醇。

圖1 采樣點地理位置Fig.1 Sampling stations of R.cylindricus in the Yangtze River

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增及測序

剪取適量鰭條，雙蒸水洗去乙醇，用高鹽法提取總DNA[12]。用魚類通用引物擴增線粒體DNA Cytb序列，引物序列為L14724：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[13]。PCR 擴增體系50 μL，包括：10× buffer(Mg2+)5 μL，dNTPs(10 md/L)0.5 μL，正反引物各2 μL，Taq DNA Polymerase(2 U)0.4 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，滅菌去離子水補至50 μL。反應程序如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，條帶明亮、清晰、單一的樣品，交由生物公司進行雙向測序，測序引物與PCR擴增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Lasergene v7.1軟件包的Seqman進行拼接，序列的對位排列用Clustal X軟件完成。用MEGA v6.0分析軟件統(tǒng)計序列的堿基組成、轉換/顛換比率，并構建鄰接系統(tǒng)發(fā)育(NJ)樹，樹檢驗采用bootstrap法，設1 000次重復。使用DnaSP v5.0獲得單倍型分布，統(tǒng)計變異位點(s)、單倍型數(shù)目(h)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)，并進行中性檢驗和歧點分布分析及Nm值計算。應用Arlequin v3.11軟件進行AMOVA分析及群體的遺傳分化指數(shù)FST。使用Network v5.003程序構建單倍型網(wǎng)絡結構圖，對單倍型之間的進化關系進行分析。根據(jù)公式τ=2 ut估算種群擴張時間，其中τ是擴張時間參數(shù)；u=2μk，其中μ為每個核苷酸的變異速率，k為序列長度；t表示自擴張以來所經(jīng)歷的代數(shù)；擴張時間T=t×代時。Beast 2.4.3.0進行Bayesian Skyline Plots(BSP)分析，采用鯉科魚類常用的進化速率每百萬年1%[14]，MCMC長度為100 000 000，在TRACER ver.1.4構圖，各項參數(shù)的ESS均大于200。

2 結果與分析

2.1 序列變異

經(jīng)校正和比對后得到圓筒吻鮈線粒體Cytb有效序列長度為998 bp，約為Cytb基因全長的87%。序列中的轉換數(shù)(Ts)明顯高于顛換數(shù)(Tv)，Ts/Tv =6.01。A、T、C、G的平均含量分別為27.64%，30.85%，27.11%和14.40%，A+T(58.49%)大于C+G(41.51%)，并顯示明顯的反G含量傾向，與其他硬骨魚類的情況相似。

在998 bp序列中發(fā)現(xiàn)14個變異位點，其中7個單一突變位點，另7個為簡約信息位點，序列間平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.772。140個個體中共檢測到15個單倍型(GenBank登錄號：MH673879-MH673893)，其中單倍型H_4出現(xiàn)的頻率最高，為58.6%，其次是H_2(13.6%)和H_3(12.1%)，有7個單倍型僅出現(xiàn)1次。7個群體中，江津群體的單倍型數(shù)最多為13個，涪陵的單倍型數(shù)最少，僅有1個(表3)。群體平均單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.625和0.000 77，最高的是瀘州群體，其次是巴南群體，涪陵群體最低(表1)。

表1 圓筒吻鮈線粒體Cyt b遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity parameters within R.cylindricus based on mtDNA Cyt b sequences

2.2 群體遺傳結構

群體間分子變異方差分析(AMOVA)顯示，群體主要變異來源為群體內(nèi)，占101.00%，群體間的遺傳分化指數(shù)FST為 -0.998%(P>0.1)(表2)，表明圓筒吻鮈7個群體間未出現(xiàn)顯著遺傳分化。

表2 圓筒吻鮈群體間分子變異分析Tab.2 Analysis of molecular variance(AMOVA)among R.cylindricus populations

對兩兩群體間的FST值進行計算(表4)，種群間FST值均低于0.05，說明群體之間未出現(xiàn)遺傳分化。Nm值表示群體間基因交流程度，其Nm>1則表明群體間存在基因交流[15]，經(jīng)計算總群體Nm值為115.80，兩兩群體Nm值見表4。

表3 圓筒吻鮈群體線粒體Cyt b序列單倍型數(shù)目及分布Tab.3 MtDNA Cyt b haplotype distribution across R.cylindricus populations

表4 圓筒吻鮈群體間的FST值(對角線下方)和基因流Nm值(對角線上方)Tab.4 Pairwise FST(below diagonal)and Nm values(above diagonal)among R.cylindricus populations

利用NETWORK里Nedian Joining方法構建圓筒吻鮈Cytb序列的單倍型網(wǎng)絡結構如圖2所示。圓筒吻鮈單倍型網(wǎng)絡結構圖以H_4為中心呈星狀結構，相鄰單倍型之間均是通過一個突變步驟連接。

以長鰭吻鮈(R.ventralis)為外類群，采用NJ法(neighbor-joining)構建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，系統(tǒng)樹未出現(xiàn)高支持率(均低于60%)的分支，說明群體內(nèi)部沒有明顯遺傳分化。

圖2 基于線粒體Cyt b序列構建圓筒吻鮈單倍型網(wǎng)絡結構圖Fig.2 Haplotype network of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

圖3 圓筒吻鮈線粒體Cyt b 單倍型NJ樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of mtDNA Cyt b in R.cylindricus

2.3 歷史種群動態(tài)

種群擴張歷史動態(tài)利用Tajima′sD和Fu′sFs中性檢驗和堿基錯配來評估。中性檢驗的Tajima′sD=-1.821 88(P<0.05)及Fu′sFs=-12.199(P<0.05)，均為顯著性負值。單倍型錯配分布分析顯示圓筒吻鮈群體的歧點分布表現(xiàn)為單峰(圖4)且BSP分析結果均表明圓筒吻鮈近期發(fā)生過經(jīng)歷過種群擴張。鯉科魚類常用的進化速率每百萬年1%[14]，根據(jù)τ=1.179，計算圓筒吻鮈在距今0.06 Ma(百萬年)前發(fā)生過種群擴張。

圖4 圓筒吻鮈Cyt b序列單倍型錯配分布圖及BSP分析Fig.4 Mismatch distribution(A)and BSP analysis(B)of R.cylindricus based on the mtDNA Cyt b sequences

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的總和，存在于生物種群間、種群內(nèi)，是生物對環(huán)境適應性和進化的基礎，物種遺傳多樣性的高低通常與該物種對環(huán)境的適應能力具有一定的線性關系，表現(xiàn)為遺傳多樣性越高，則表明對環(huán)境的適應能力越強[16-17]。單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)是衡量物種遺傳多樣性水平高低的兩個重要指標[18]，Pi值越大則表示群體多態(tài)性較高，反之亦然[16]。與長江上游其它魚類，如紅唇薄鰍(L.rubrilaris)[19](Pi=0.006)、長鰭吻鮈[20](Pi=0.001)、異鰾鰍鮀(X.boulengeri)[21](Pi=0.002)等比較，長江中上游圓筒吻鮈群體遺傳多樣性處于較低水平。本研究以前，曾曉蕓[10]也采用Cytb分析過長江上游圓筒吻鮈群體遺傳結構，得到Pi=0.010 06，明顯大于本研究的結果，暗示圓筒吻鮈群體遺傳多樣性存在下降趨勢。從單倍型來看，曾曉蕓的研究結果中，頻率最高的3個單倍型(Hap_1：45.1%、Hap_2：20.5%和Hap_3：8.2%)占總樣本量為73.8%，本研究的頻率最高的3個單倍型比例為84.3%，提示近年來圓筒吻鮈群體同質化有所提高，值得關注。造成圓筒吻鮈遺傳多樣性下降的原因可能是過度捕撈造成種群大小下降，引起群體遺傳漂變加劇。研究表明，長江上游圓筒吻鮈資源開發(fā)率偏高[6，9]，資源量呈下降趨勢。

研究還發(fā)現(xiàn)位于三峽庫區(qū)的庫尾涪陵群體沒有檢測到遺傳變異，僅有一個單倍型(表3)。圓筒吻鮈屬喜流水性魚類，涪陵江段在三峽水庫低水位時江水存在一定的流動性，高水位時，江水幾乎不流動，因此不是圓筒吻鮈適宜的棲息地，但該江段的研究有助于分析大壩建設形成的水庫對喜流水性魚類的影響。本研究還顯示，長江中游的黃岡群體遺傳多樣性較低(表1)，有研究表明長江上游圓筒吻鮈資源量大于中游[3，9]，說明長江上游較中游而言是圓筒吻鮈較適宜的棲息地，并且圓筒吻鮈在中游面臨與更多大型魚類競爭食物的壓力等，這些可能是造成其群體遺傳多樣性降低的原因。但由于這兩個群體的樣本量比較少，還需要加強采樣，進一步研究。

3.2 遺傳結構及種群歷史

溯祖理論[22]認為分布最廣泛的單倍型為原始單倍型?；贑ytb序列的單倍型網(wǎng)絡結構圖(圖2)顯示，H_4位于網(wǎng)絡結構中心，為主要單倍型，在7個群體中均有分布，說明H_4單倍型的圓筒吻鮈對環(huán)境的適應能力較強。AMOVA和基因流及兩兩群體之間的遺傳分化分析均表明長江中上游圓筒吻鮈群體遺傳分化不顯著(表2和表4)，但基因流檢測顯示，涪陵群體與其它群體(瀘州群體除外)的Nm均小于4，黃岡群體與其他群體(瀘州群體除外)的Nm值也均小于4(表4)，說明這些群體間的基因交流可能存在一定障礙?？紤]到涪陵和黃岡群體樣本量小，Cytb序列的變異位點數(shù)量也較少，對分析的結果可能會造成一定的影響，因此有必要采集更多樣本和采用多態(tài)性更高的標記，如mtDNA控制區(qū)[23]、微衛(wèi)星DNA等進一步研究驗證。

Grant等[24]根據(jù)海水魚類單倍型多樣性和核苷酸多樣性的高低推測群體歷史狀況之間的關系，可分為四種情況：(1)低單倍型多樣性(<0.5)和低核苷酸多樣性(<0.005)，說明種群近期發(fā)生瓶頸或奠定者由單個或少數(shù)mtDNA譜系組成；(2)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性，說明群體種群發(fā)生瓶頸后迅速增長并積累突變；(3)低單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，說明地理隔離的亞群體出現(xiàn)分化；(4)高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，說明具有長進化歷史的穩(wěn)定群體或有譜系差異的群體再次融合。本研究結果顯示，圓筒吻鮈群體遺傳多樣性與上述第二種類型相符，說明圓筒吻鮈群體發(fā)生遺傳瓶頸和群體擴張歷史，這與中性檢驗、堿基錯配分布及BSP分析的結果吻合。研究表明，長江上游的一些魚類如紅唇薄鰍、長薄鰍(L.elongate)[19]、長鰭吻鮈[20]在長江上游末次冰期，即大理亞冰期(1～11萬)發(fā)生過種群擴張，此時期長江上游氣溫回升，有利于魚類的生存和擴張[25]。

3.3 保護建議

本研究顯示，長江中上游圓筒吻鮈群體沒有發(fā)生遺傳結構分化，與之前研究結果比較，其圓筒吻鮈群體遺傳多樣性存在下降趨勢，需要開展長期遺傳多樣性監(jiān)測。近年來，漁民為了獲得更多利益而改變了網(wǎng)具規(guī)格，不斷縮小其網(wǎng)具的捕撈規(guī)格，資源量不斷減少，有效繁殖群體難以恢復。因此，應采取有效措施(如禁漁期、漁民轉業(yè)等)并加強對圓筒吻鮈的保護力度。從本研究得知，7個群體之間及群體內(nèi)部都沒有明顯的遺傳分化，因此，我們建議將圓筒吻鮈作為一個整體進行就地保護，并開展長期監(jiān)測。