但 言，沈子偉，余鳳琴，張 闖 ，倪朝輝，黎 春

(1.重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所，重慶 401120 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223 3.重慶市巫山縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)，重慶巫山 404700)

水是維持人和動(dòng)物生命及漁業(yè)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最基本也是最重要的資源。而水中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素及有機(jī)物，亦使其成為微生物生產(chǎn)和繁殖的重要場(chǎng)所[1]。微生物是河流生態(tài)環(huán)境中的主要初級(jí)生產(chǎn)者[2]。河流環(huán)境的變化會(huì)對(duì)河流微生物的種群分布造成影響，因此河流微生物的種群分布可以作為判斷河流生態(tài)環(huán)境是否遭到破壞的生物指標(biāo)[3]。近年來(lái)分子生物學(xué)快速發(fā)展，低成本、自動(dòng)化的高通量測(cè)序技術(shù)[4，5]，能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)，快速準(zhǔn)確地獲得樣品中微生物群落的組成，在河流[6]和湖泊水庫(kù)[7]的微生物群落結(jié)構(gòu)研究中得到廣泛應(yīng)用。

嘉陵江為長(zhǎng)江上游的主要支流，對(duì)嘉陵江的水體研究主要包括浮游生物多樣性[8，9]、有毒重金屬研究[10，11]和營(yíng)養(yǎng)鹽濃度[12-14]，尚未見(jiàn)水體和底泥微生物群落的相關(guān)研究，尚不清楚嘉陵江水體的微生物群落組成與其環(huán)境因子的關(guān)系。本研究在嘉陵江下游合川段草街電站庫(kù)區(qū)范圍內(nèi)開(kāi)展?；?6S rRNA V4區(qū)域擴(kuò)增子測(cè)序分析技術(shù)，在9月份對(duì)嘉陵江合川段進(jìn)行采樣，分析水體和底泥微生物結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，以期為嘉陵江流域的環(huán)境監(jiān)測(cè)和污染防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

嘉陵江位于東經(jīng)103°45′～109°00′，北緯29°20′～34°25′之間，其左右岸支流(渠江和涪江)在合川城區(qū)匯入嘉陵江干流，而后在重慶朝天門(mén)匯入長(zhǎng)江。

在利澤(LZ)、渠江口(QJ)、涪江口(FJK)、草街(CJ)設(shè)置4個(gè)采樣斷面，其中利澤斷面在渠江口上游，草街?jǐn)嗝嬖诓萁炙畮?kù)大壩以上(圖1)。水體樣品以S.LZ、S.QJ、S.FJK、S.CJ表示，底泥樣品以N.LZ、N.QJ、N.FJK、N.CJ表示。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖(1.利澤，2.渠江口，3.涪江口，4.草街)Fig.1 The location of the sampling sites

1.2 樣品采集

1.3 樣品DNA提取、PCR和16S rDNA測(cè)序

水樣和底泥樣品送至諾和致源公司(北京)，分離水樣和底泥基因組DNA用于16S rRNA基因的擴(kuò)增和測(cè)序。細(xì)菌DNA提取按照CTAB方法進(jìn)行。擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S V4，擴(kuò)增引物為515F-806R。酶和緩沖液：使用New England Biolabs 公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 反應(yīng)體系和程序(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL，Primer(2 μmd/L)3 μL(6 μmd/L)，gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。各樣品PCR擴(kuò)增后，利用HiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個(gè)樣品的OTUs 和分類(lèi)譜系的基本分析結(jié)果。再對(duì)OTUs 進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。最后在以上分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一系列的基于OTUs、物種組成的聚類(lèi)分析，主成分分析(principal component analysis，PCA)、典型相關(guān)分析(canonical correlation analyses，CCA)等統(tǒng)計(jì)比較分析。

2 結(jié)果

2.1 微生物群落多樣性指數(shù)分析

利用諾和致源公司線上分析平臺(tái)分析4個(gè)采樣點(diǎn)水樣和底泥中的微生物多樣性指數(shù)，包括：觀察物種指數(shù)(obsevered species)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)、辛普森指數(shù)(Simpson index)和ACE指數(shù)等。水體中obsevered species指數(shù)介于678～989之間，底泥介于1 362～2 219之間。水體中香農(nóng)指數(shù)介于3.27～6.89之間，辛普森指數(shù)介于0.68～0.97之間；底泥香農(nóng)指數(shù)介于5.49～8.35之間，辛普森指數(shù)介于0.88～0.98之間，說(shuō)明樣品的均勻度和多樣性較好。水體中Chao 1指數(shù)介于932～1 343之間，AEC指數(shù)介于1 012～1 399之間；底泥中Chao 1介于1 970～2 560之間，AEC指數(shù)介于1 895～2 637之間，表明樣品的豐度較大。

圖2為嘉陵江合川段水體和底泥中微生物豐度指數(shù)圖，由圖2可以看出：草街水體和底泥中微生物的多樣性較其他3個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)均為最佳。

表1 微生物多樣性指數(shù)分析Tab.1 Analysis of microbial diversity index

圖2 水體和底泥中主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)群落結(jié)構(gòu)組成Fig.2 Composition of the main dominant microbial community structure in water and sediment

2.2 微生物群落組成

嘉陵江合川段水體中優(yōu)勢(shì)微生物門(mén)類(lèi)有：變形菌門(mén)(Proteobacteria，53.2%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，23.1%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，11.8%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，4.9%)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria，9.6%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes，1.9%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia，1.1%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，1.0%)、綠菌門(mén)(Chlorobi，0.5%)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes，0.2%)。底泥中優(yōu)勢(shì)微生物門(mén)類(lèi)有：變形菌門(mén)(Proteobacteria，42.2%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，32.3%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，8.0%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，4.3%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，3.4%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia，2.3%)、綠菌門(mén)(Chlorobi，1.2%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes，1.1%)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospira，0.9%)、Ignavibacteriae(0.5%)。

2.3 微生物群落的空間分布

從嘉陵江合川段水體和底泥的微生物聚類(lèi)樹(shù)狀圖(圖3)中可直接看出8個(gè)樣品之間微生物群落多樣性的相似性。嘉陵江合川段水體和底泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成均差異較大。4個(gè)水體樣品中均可聚為一類(lèi)，說(shuō)明各水體樣品中的微生物群落組成較為相似。而底泥中利澤與其他3個(gè)樣品的微生物群落表現(xiàn)出較大的差異，涪江口和渠江口聚類(lèi)較近，微生物群落的結(jié)構(gòu)較為相似。

圖3 微生物聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.3 Microbial clustering tree

圖4為微生物PCA分析，圖中的點(diǎn)代表各樣品，樣品間的相似度越高則在圖中越近，反之樣品間相似度越低則在空間距離越遠(yuǎn)。由圖4也可以看出水體中的微生物相似度較高，而草街底泥中的微生物與其他樣品的微生物結(jié)構(gòu)差異較大。

圖4 微生物PCA分析Fig.4 Microbial PCA analysis

2.4 物種豐度聚類(lèi)熱圖分析

圖5為微生物在genus水平物種豐富熱度圖，在水體中的優(yōu)勢(shì)微生物屬有：氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)，GKS98-freshwater-group屬，Chthoniobacter屬，鞘脂菌屬(Phingobium)，Prevotella-6屬，嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，Masslilia屬，Psychobacter屬；而在底泥中有不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，杜檊氏屬(Duganell)，Sporacetigenium屬，Psychrobacillus屬，Pseudarthrobacter屬，Paeniglutamicibacter屬，芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)，F(xiàn)erruginibacter，Chthoniobacter屬，F(xiàn)usibacter屬，Unidentified-Nitrosomonadaceae屬，Novosphinggobium屬。

圖5 微生物物種豐度聚類(lèi)熱圖(a：水體，b：底泥)Fig.5 Abundance clustering heat map of microbial species

2.5 環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

CCA分析用來(lái)分析環(huán)境因子對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)的環(huán)境因子主要有：總磷(TP)、總氮(TN)、pH、懸浮物、高錳酸鹽指數(shù)、溶解氧、石油類(lèi)和揮發(fā)酚含量。各環(huán)境因子數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，對(duì)各環(huán)境因子進(jìn)行CCA分析，結(jié)果表明，水體TP、TN及pH和水體中微生物結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)(P<0.05)，TP、TN及pH是影響水體中微生物結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。而在這三個(gè)環(huán)境因子中，TP是影響草街水域微生物結(jié)構(gòu)主要環(huán)境因子，TN是影響渠江口水域微生物結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，pH是影響涪江口水域微生物結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子(圖6)。

表2 水體環(huán)境因子Tab.2 Environmental factor of water

圖6 環(huán)境因子分析Fig.7 Environmental factor analysis

3 討論

3.1 水體和底泥微生物多樣性差異

底泥樣品中平均香農(nóng)指數(shù)大于水體樣品，表明水體和底泥中的微生物結(jié)構(gòu)存在差異，底泥中微生物的種類(lèi)更為豐富?？赡苁堑啄喹h(huán)境復(fù)雜，滿足厭氧微生物類(lèi)群的生存環(huán)境條件，一系列的生物化學(xué)反應(yīng)在此發(fā)生，因此底泥中微生物物種多樣性更為豐富。

水體中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群門(mén)類(lèi)為：變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)，底泥中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群為：變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。水體中的特有優(yōu)勢(shì)種群為：藍(lán)細(xì)菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)，底泥中的特有優(yōu)勢(shì)種群為硝化螺旋菌門(mén)和Ignavibacteriae。其中變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在淡水富營(yíng)養(yǎng)化水體中都是十分常見(jiàn)的[15]，說(shuō)明嘉陵江合川段水域2017年秋季有富營(yíng)養(yǎng)化趨勢(shì)。水體、底泥微生物群落特征及微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)研究[16]表明厚壁菌門(mén)是一類(lèi)在廢水、廢棄物厭氧處理系統(tǒng)中起重要作用的微生物，在水體中出現(xiàn)較多的厚壁菌門(mén)，說(shuō)明水體已面臨污染脅迫。藍(lán)細(xì)菌門(mén)在水體中占9.6%，提示水體有富營(yíng)養(yǎng)化趨勢(shì)。相關(guān)研究表明，一種可裂解藍(lán)藻細(xì)胞的噬細(xì)胞菌(擬桿菌門(mén)細(xì)菌)的增多與水華的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系[17]，因此擬桿菌門(mén)可能與富營(yíng)養(yǎng)化存在某種潛在關(guān)系[15]。此外，擬桿菌是一類(lèi)常見(jiàn)于人和動(dòng)物體內(nèi)且大量存在的致病菌，其下面多個(gè)菌屬可以分解高分子碳水化合物，例如多形擬桿菌具有分解多糖功能，底泥中擬桿菌比例相對(duì)較高，提示該區(qū)域受到人類(lèi)活動(dòng)較大影響。硝化螺旋菌門(mén)是一類(lèi)硝化細(xì)菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，底泥中的硝化螺旋菌門(mén)占0.9%，說(shuō)明底泥中細(xì)菌硝化作用較為活躍，水環(huán)境自凈能力較強(qiáng)。2012—2013年長(zhǎng)江上游支流赤水河茅臺(tái)地區(qū)水體微生物優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)，秋季(10月)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)[18]，這與嘉陵江合川段水體中微生物優(yōu)勢(shì)物種組成類(lèi)似，由此推測(cè)長(zhǎng)江上游水體中微生物優(yōu)勢(shì)物種構(gòu)成可能普遍相似。此外，茅臺(tái)地區(qū)赤水河的研究結(jié)果[18]表明，某個(gè)季節(jié)微生物的多樣性基本能反映地區(qū)全年的整體情況，因此對(duì)2017年秋季的嘉陵江合川段水域底泥微生物多樣性進(jìn)行分析，基本能夠代表嘉陵江合川段全年微生物多樣性的情況。

3.2 各采樣點(diǎn)微生物組成分析

利澤和涪江口，渠江口和草街水體微生物物種多樣性組成相似，表明河流上下游水體微生物物種組成均一性較好，采樣位置差異對(duì)微生物物種多樣性的組成影響不大。而Gao等[19]研究污染河流時(shí)發(fā)現(xiàn)上下游微生物物種組成存在差異，譚旭等[18]也發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)地區(qū)赤水河上游較下游微生物群落多樣性有微弱的優(yōu)勢(shì)，這都與該研究結(jié)果不同，可能的原因是嘉陵江合川段處在草街水電站庫(kù)區(qū)范圍內(nèi)，水生態(tài)環(huán)境較為均一，與自然河道有較大差異，且沒(méi)有對(duì)微生物結(jié)構(gòu)造成顯著影響的持續(xù)污染源，因此河流上下游水體的微生物物種組成相似。而茅臺(tái)地區(qū)赤水河流速大，水生態(tài)環(huán)境多樣，下游生產(chǎn)生活對(duì)河水物質(zhì)組成產(chǎn)生很大影響，因此上下游微生物組成表現(xiàn)出差異。但是，實(shí)驗(yàn)中各采樣點(diǎn)微生物豐度的不同主要是人類(lèi)活動(dòng)的影響。下游草街采樣點(diǎn)距草街電站距離較近，水文條件長(zhǎng)期穩(wěn)定，適宜微生物的繁殖，水體中各種微生物豐度均較大。茅臺(tái)地區(qū)赤水河下游微生物豐度比上游樣品高[18]，這與張旭[16]的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明河流微生物結(jié)構(gòu)組成與水文環(huán)境和人類(lèi)活動(dòng)影響方式的不同密切相關(guān)。草街水域豐度較大的微生物為變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)。其中放線菌可以吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)水體有凈化作用[20]，疣微菌門(mén)則是富營(yíng)養(yǎng)化水體中常見(jiàn)的細(xì)菌[21]。最上游采樣點(diǎn)利澤微生物豐度也較大，主要為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。渠江口能分解有機(jī)物的[22]氫噬胞菌屬豐度最大，涪江口處在合川城區(qū)，生活、生產(chǎn)及運(yùn)輸帶入大量有機(jī)物，因此涪江口氫噬胞菌有機(jī)物分解作用較其他三個(gè)采樣點(diǎn)更為活躍。

涪江口和渠江口底泥中微生物物種多樣性組成相似，這兩處采樣點(diǎn)是嘉陵江與其支流涪江與渠江的匯合處，都分布在城區(qū)范圍內(nèi)。張旭[16]的研究結(jié)果表明，城區(qū)和郊區(qū)底泥表現(xiàn)出不同的微生物多樣性，底泥微生物群落結(jié)構(gòu)與區(qū)域相關(guān)，這也與本次研究結(jié)果相一致。從微生物豐度上看，豐度較大的微生物主要為不動(dòng)桿菌屬和杜檊氏屬，杜檊氏屬能夠降解水體中的有機(jī)物，起到凈化水體的作用[23]，這也與涪江口和渠江口地處城區(qū)有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)上游和下游的利澤和草街底泥中豐度較大的微生物較多，可能的原因是城區(qū)較為密集的人類(lèi)活動(dòng)導(dǎo)致某些微生物生長(zhǎng)繁殖受到影響。

3.3 環(huán)境對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的影響

Wang等[24]表明，生態(tài)系統(tǒng)中微生物結(jié)構(gòu)是非隨機(jī)空間分布的，但影響微生物組成的主要環(huán)境因子并不固定。本研究中，總磷、總氮和pH對(duì)水體中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化有較大的影響。Sterner等[25]研究表明，細(xì)菌生長(zhǎng)受到生物體和基質(zhì)中N/P、C/N和C/P組成的影響。基質(zhì)中元素比變化會(huì)引起細(xì)菌進(jìn)行酶活性、基因表達(dá)和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)，最終影響物種之間競(jìng)爭(zhēng)和占位，并引起優(yōu)勢(shì)物種和生物多樣性的改變[26]。

黃藝等[27]認(rèn)為浮游細(xì)菌生物完整性指數(shù)(BP-IBI)可用于滇池流域生態(tài)健康的評(píng)價(jià)。張旭[16]以寧波境內(nèi)河流為例建立了微生物生物性完整性指標(biāo)，評(píng)價(jià)河流水體生態(tài)健康狀況。微生物群落多樣性是水環(huán)境敏感性生物指標(biāo)之一，隨著水環(huán)境的變化，具有不同的結(jié)構(gòu)特征，水生態(tài)環(huán)境與微生物結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，通過(guò)微生物群落結(jié)構(gòu)變化能夠預(yù)測(cè)環(huán)境質(zhì)量的變化。開(kāi)展嘉陵江乃至長(zhǎng)江流域微生物結(jié)構(gòu)研究，建立微生物指標(biāo)評(píng)價(jià)，對(duì)水環(huán)境保護(hù)和水體及底泥污染的生物治理具有參考意義。