王志強(qiáng)，劉 寒，耿瑞靜，王衛(wèi)民

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

魚鱗作為魚類重要的皮膚衍生物，由皮膚原始干細(xì)胞定向分化而來[1]。魚類鱗片和鰭條一樣，同屬魚類外骨骼，除對(duì)魚體起到保護(hù)作用外[2-3]，魚類鱗片形態(tài)結(jié)構(gòu)也是研究魚類分類特征、生存環(huán)境和生長(zhǎng)特性的重要依據(jù)[4-5]。對(duì)于鱗片的發(fā)生位置和覆蓋過程的研究，不僅可以了解魚類的生長(zhǎng)規(guī)律，判斷魚苗生長(zhǎng)狀況，還能夠?qū)︳~類的演化過程和親緣關(guān)系進(jìn)行探討和鑒定[6-8]。此外，有研究表明不同物種的魚類之間的鱗片發(fā)育過程差異不大[9]，但其發(fā)生的位置和覆蓋方式則有很大不同[10-11]。

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Culterinae)魴屬，是我國(guó)特有的草食性經(jīng)濟(jì)魚類[12]。為合理保護(hù)和開發(fā)利用團(tuán)頭魴資源，諸多學(xué)者針對(duì)團(tuán)頭魴的早期發(fā)育、人工繁殖與養(yǎng)殖等開展了大量研究工作[13-15]。在其鱗片相關(guān)研究中，孟慶聞等[16]在對(duì)團(tuán)頭魴相關(guān)器官進(jìn)行觀察研究時(shí)，對(duì)團(tuán)頭魴鱗片的發(fā)育進(jìn)行了簡(jiǎn)要概括。熊金林等[17]對(duì)低齡團(tuán)頭魴鱗片上的環(huán)紋與生長(zhǎng)之間的關(guān)系做了探究。但是關(guān)于團(tuán)頭魴鱗片的發(fā)生發(fā)育過程及與斑馬魚(Daniorerio)的比較研究尚未見報(bào)道。本研究主要采用形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法系統(tǒng)地比較研究了團(tuán)頭魴稚魚和斑馬魚稚魚鱗片的發(fā)生位置和覆蓋過程，初步闡明了團(tuán)頭魴和斑馬魚鱗片發(fā)育的基本規(guī)律，探討了鱗片覆蓋與個(gè)體年齡和生長(zhǎng)的關(guān)系，為探討魚類鱗片的發(fā)育模式提供了豐富的材料，為進(jìn)一步研究魚類鱗片發(fā)生發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來源與管理

團(tuán)頭魴親本均來自湖北省鄂州市國(guó)家級(jí)團(tuán)頭魴良種場(chǎng)。經(jīng)人工授精獲得團(tuán)頭魴胚胎，在25 ℃水溫中靜水孵化，充氧泵充氧。出膜后仔魚放入白色塑料盒(80.0 cm×55.0 cm×20.0 cm)中喂養(yǎng)，水溫(24.5±0.5)℃。出膜3 d后，開始投喂人工孵化的鹵蟲無節(jié)幼體。出膜14 d后，開始投喂浮游動(dòng)物，每天早晚各一次。及時(shí)清理食物殘?jiān)凹S便，每3 d換水一次。

斑馬魚親本均購自國(guó)家斑馬魚資源中心，放入斑馬魚循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖。人工配對(duì)得到斑馬魚胚胎，收集至玻璃皿中孵化，水溫控制在28 ℃，每天換水一次。出膜3 d后轉(zhuǎn)至白色盒子中暫養(yǎng)，開始喂食草履蟲，每天早晚各一次。出膜20 d后，轉(zhuǎn)至較大白盒子中，充氧泵充氧。及時(shí)清理食物殘?jiān)凹S便，每3 d換水一次。

1.2 樣本的收集與處理

第一批團(tuán)頭魴出膜后20 d開始取樣一直到出膜后80 d，斑馬魚出膜后25 d開始取樣一直到出膜后55 d。每間隔2 d取樣一次，每次取樣10尾，用4%多聚甲醛固定，其中5尾用于茜素紅染色觀察鱗片出現(xiàn)的位置及鱗片的覆蓋情況，5尾用于組織切片觀察。

1.3 魚體鱗片染色與組織切片觀察

鱗片染色的方法結(jié)合李思發(fā)[11]與鮑寶龍等[18]的茜素紅染色法稍作調(diào)整，具體如下：(1)將固定于4%多聚甲醛中的標(biāo)本用ddH2O漂洗30 min，重復(fù)3次；(2)用TBST(1 L體積：6 g Trisbase，pH 7.4，8.275 g NaCl，1 mL Trition X-100)溫和漂洗，進(jìn)一步除去殘留甲醛和樣本脂肪組織；(3)將魚浸泡在1% KOH中，滴加1% H2O2，強(qiáng)光下照射除去大部分色素，當(dāng)標(biāo)本表面出現(xiàn)氣泡時(shí)終止反應(yīng)(具體時(shí)間根據(jù)魚體大小調(diào)整)；(4)待色素去除后，用蛋白酶液(100 mL體系：65 mL ddH2O，35 mL飽和硼酸鈉鹽，1 g胰蛋白酶)消化肌肉組織，直至魚體變透明；(5)將透明樣本放入1% KOH溶液中，慢慢滴加茜素紅溶液(1 g茜素紅溶于100 mL 0.5% KOH)，待魚體表面染成淺紫色為止；(6)將標(biāo)本放入1% KOH溶液中漂洗，除去多余染液后在體式顯微鏡下觀察、拍照。

對(duì)4%多聚甲醛固定的樣本進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，分別進(jìn)行H&E和Masson染色，在正置顯微鏡下進(jìn)行鱗片發(fā)生的組織學(xué)觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用鱗片覆蓋率(鱗片出現(xiàn)的排數(shù))作為判斷鱗片覆蓋的指標(biāo)。應(yīng)用軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，并繪制鱗片覆蓋率與日齡、體長(zhǎng)的關(guān)系曲線。

2 結(jié)果

2.1 鱗片發(fā)生的位置及覆蓋過程

團(tuán)頭魴在體長(zhǎng)15.5 mm之前未觀察到有鱗片出現(xiàn)(圖1A)。出膜后24 d，體長(zhǎng)達(dá)到16.3～19.7 mm時(shí)，團(tuán)頭魴鰓蓋后緣側(cè)線處開始出現(xiàn)鱗片(圖1B)，之后從該位置沿側(cè)線向尾柄部延伸，同時(shí)也沿鰓蓋后緣上下擴(kuò)展，前者的速度要快于后者，并且沿鰓蓋后緣向下要早于向上覆蓋。出膜26 d，體長(zhǎng)達(dá)到19.9～20.6 mm時(shí)，團(tuán)頭魴軀干前部的側(cè)線下鱗已覆蓋兩排，而側(cè)線上鱗還未發(fā)現(xiàn)(圖1C)。出膜后30 d，體長(zhǎng)達(dá)到21.1～21.8 mm時(shí)，魚體軀干軸下側(cè)鱗片基本覆蓋完全(圖1D)。出膜后34 d，體長(zhǎng)達(dá)到22.3～23.2 mm時(shí)，鱗片開始向脊椎上側(cè)發(fā)展，尾部側(cè)線以上部位也開始有鱗片出現(xiàn)，并與軀干側(cè)線以上部位出現(xiàn)的鱗片慢慢匯合(圖1E)。出膜后44 d，體長(zhǎng)達(dá)到23.9～24.6 mm時(shí)，團(tuán)頭魴全身鱗片基本覆蓋完成(圖1F)。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期團(tuán)頭魴鱗片覆蓋過程Fig.1 The scales development at different stages of M.amblycephala(A)出膜后第22 d，體長(zhǎng)14.54 mm；(B)出膜后第24 d，體長(zhǎng)19.62 mm；(C)出膜后第26 d，體長(zhǎng)20.33 mm；(D)出膜后第30 d，體長(zhǎng)21.55 mm；(E)出膜后第34 d，體長(zhǎng)22.80 mm；(F)出膜后第44 d，體長(zhǎng)24.12 mm

斑馬魚鱗片的起始位置和覆蓋方式與團(tuán)頭魴有所不同。斑馬魚在體長(zhǎng)約6.9～7.1 mm之前未觀察到有鱗片出現(xiàn)(圖2A)。出膜后39 d，體長(zhǎng)達(dá)到8.5～9.2 mm時(shí)，在斑馬魚尾柄側(cè)線處首先出現(xiàn)鱗片，隨后鱗片開始由尾部沿側(cè)線向前開始覆蓋，同時(shí)側(cè)線上下兩側(cè)也開始出現(xiàn)鱗片(圖2B)。當(dāng)體長(zhǎng)達(dá)到9.7～10.2 mm時(shí)，斑馬魚尾部及側(cè)線鱗已覆蓋完全，側(cè)線上、下鱗已有1～2排出現(xiàn)(圖2C)。當(dāng)體長(zhǎng)達(dá)到10.9～11.5 mm時(shí)，斑馬魚側(cè)線上、下鱗已出現(xiàn)2～3排，魚體鱗片總排數(shù)達(dá)到5排(圖2D)。隨著鱗片繼續(xù)沿側(cè)線向上、下擴(kuò)展，當(dāng)體長(zhǎng)達(dá)到11.6～11.9 mm時(shí)，斑馬魚體表除腹部以及背部以外，大部分區(qū)域鱗片已基本覆蓋(圖2E)體長(zhǎng)達(dá)到12.1～12.5 mm時(shí)，斑馬魚全身鱗片覆蓋完全(圖2F)。

圖2 不同發(fā)育時(shí)期斑馬魚鱗片覆蓋過程Fig.2 The scales development at different stages of D.rerio(A)出膜后第33 d，體長(zhǎng)7.04 mm；(B)出膜后第39 d，體長(zhǎng)8.96 mm；(C)出膜后第45 d，體長(zhǎng)9.93 mm；(D)出膜后第45 d，體長(zhǎng)11.30 mm；(E)出膜后第43 d，體長(zhǎng)11.63 mm；(F)出膜后第47 d，體長(zhǎng)12.20 mm

2.2 鱗片發(fā)生的組織學(xué)觀察

為了清楚地研究團(tuán)頭魴和斑馬魚鱗片發(fā)生的主要過程，實(shí)驗(yàn)采用不同的組織切片染色方法，即H&E染色和Masson染色對(duì)其進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明團(tuán)頭魴的鱗片發(fā)生過程主要經(jīng)歷了以下幾個(gè)階段：

形態(tài)發(fā)生早期：成纖維細(xì)胞在表皮的生發(fā)層下聚集(圖3A，圖4A)，隨著成纖維細(xì)胞在表皮與真皮臨界處的大量出現(xiàn)，形成一層單獨(dú)細(xì)胞層(圖3B，圖3C，圖4B)。

形態(tài)發(fā)生晚期：在表皮與真皮臨界處的成纖維細(xì)胞繼續(xù)分化成更大的細(xì)胞，開始形成鱗片乳突(圖3D，圖4C，圖4D)。

分化早期：鱗片乳突不斷分化成為兩層鱗片生成細(xì)胞，并不斷分泌骨質(zhì)，形成骨質(zhì)薄片即為鱗片原基(圖3E)。鱗片上下層出現(xiàn)新的真皮細(xì)胞層，形成包圍鱗片的小囊，即鱗囊(圖3F，圖4E，圖4F)。

分化晚期：鱗囊繼續(xù)擴(kuò)大，鱗片基質(zhì)更加明顯(圖3G，圖4G)。

圖3 團(tuán)頭魴稚魚鱗片發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)(H&E染色)Fig.3 The histology of scales development in juvenile M.amblycephala(H&E staining)(A-C)形態(tài)發(fā)生早期：(A)皮膚的表皮和真皮；(B)成纖維細(xì)胞開始在表皮層發(fā)生聚集；(C)成纖維細(xì)胞進(jìn)入真皮層中部；(D)形態(tài)發(fā)生晚期：成纖維細(xì)胞堆積形成乳突；(E-F)分化早期：(E)鱗片乳突不斷分泌骨質(zhì)，鱗片原基形成；(F)鱗囊形成；(G)分化晚期：鱗囊繼續(xù)擴(kuò)大，鱗片基質(zhì)更加明顯；(H)折疊期：表皮在鱗片末端折疊，鱗片形成ep：表皮；de：真皮；fb：成纖維細(xì)胞；bc：基底細(xì)胞；el：外層細(xì)胞；ef：彈性纖維；scp：鱗片乳突；sfc：鱗片形成細(xì)胞；sp：鱗囊；sc：鱗片

圖4 團(tuán)頭魴稚魚鱗片發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)(Masson染色)Fig.4 The histology of scale development in juvenile M.amblycephala(Masson staining)

折疊期：表皮開始在鱗片后端邊緣折疊，鱗囊進(jìn)一步擴(kuò)大，相鄰的鱗片發(fā)生重疊，形成成熟的鱗片(圖3H，圖4H)。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的鱗片發(fā)生過程與團(tuán)頭魴基本相同，也主要經(jīng)歷了形態(tài)發(fā)生早期、形態(tài)發(fā)生晚期、分化早期、分化晚期和折疊期，共五個(gè)時(shí)期，各個(gè)發(fā)育時(shí)期的具體變化與團(tuán)頭魴相同，詳見圖5、圖6。

圖5 斑馬魚稚魚鱗片發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)(H&E染色)Fig.5 The histology of scales development in juvenile D.rerio(H&E staining)A-B形態(tài)發(fā)生早期：(A)成纖維細(xì)胞開始在表皮生發(fā)層聚集；(B)成纖維細(xì)胞進(jìn)入真皮層中部；(C)形態(tài)發(fā)生晚期：成纖維細(xì)胞堆積形成乳突；D-E分化早期：(D)鱗片乳突不斷分泌骨質(zhì)，鱗片原基形成；(E)鱗囊形成；F-G分化晚期：(F)鱗囊繼續(xù)擴(kuò)大，鱗片基質(zhì)更加明顯；(H)折疊期：表皮在鱗片末端折疊，鱗片形成。

圖6 斑馬魚稚魚鱗片發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)(Masson染色)Fig.6 The histology of scales development in juvenile D.rerio(Masson staining)

2.3 鱗片覆蓋與體長(zhǎng)和日齡的關(guān)系

鱗片覆蓋率(coverage rate，CR)指標(biāo)，與體長(zhǎng)(body length，L)和出膜后的日齡(days post hatching，D)的關(guān)系如圖7所示。團(tuán)頭魴鱗片覆蓋率與體長(zhǎng)的關(guān)系為CR=-0.000 7L3+0.040 3L2- 0.683 3L+3.560 1(R2=0.794 5，P=0.000)(圖7A)；團(tuán)頭魴鱗片覆蓋率與日齡的關(guān)系為CR=0.000 0D3- 0.000 3D2+0.039 0D- 0.684 5(R2=0.412 9，P=0.000)(圖7B)。通過SPSS 17.0軟件計(jì)算得到團(tuán)頭魴鱗片覆蓋率與體長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)為0.864，相關(guān)性較強(qiáng)(r=0.864，P=0.000)，團(tuán)頭魴鱗片覆蓋率與日齡相關(guān)系數(shù)為0.609，成弱相關(guān)性(r=0.609，P=0.000)。斑馬魚鱗片覆蓋率與體長(zhǎng)的關(guān)系為CR=-0.004 8L3+0.162 1L2- 1.609L+4.951 7，(R2=0.803，P=0.000)(圖7C)；斑馬魚鱗片覆蓋率與日齡的關(guān)系為CR=-0.000 3D3+0.029 5D2- 1.059 9D+12.169(R2=0.524 5，P=0.000)(圖7D)。斑馬魚鱗片覆蓋率與體長(zhǎng)的相關(guān)系數(shù)為0.858，呈強(qiáng)相關(guān)性(r=0.858，P=0.000)，斑馬魚鱗片覆蓋率與日齡相關(guān)系數(shù)為0.603，呈弱相關(guān)性(r=0.603，P=0.000)。

圖7 團(tuán)頭魴(A和B)和斑馬魚(C和D)稚魚鱗片的覆蓋率與體長(zhǎng)、日齡的關(guān)系Fig.7 Variation in areal coverage of scales by body length and age during development in juvenile M.amblycephala(A and B)and D.rerio(C and D)

3 討論

3.1 魚類鱗片發(fā)育的起始位置和數(shù)量

魚類鱗片的發(fā)生發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不同魚類的鱗片發(fā)育模式不盡相同。本研究結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴鱗片最先起始于鰓蓋后緣側(cè)線處，這種鱗片起始位置與鯉科魚類的草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[11]、鳙(Aristichthysnobilis)[11]、重口裂腹魚(Schizothoraxdavidi)[19]和齊口裂腹魚(S.prenanti)[20]的鱗片起始位置一致。而斑馬魚的鱗片起始位置與團(tuán)頭魴的鱗片起始位置明顯不同，其為尾柄側(cè)線處，這與小孔亞口魚(Minytremamelanops)[8]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]、莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)[21]、奧克蘭鰻鱺(Anguillaaustralis)[22]、大鰻鱺(A.dieffenbachii)[22]的鱗片起始位置一致。此外有些魚類鱗片起始位置并不屬于以上兩種類型，如梭魚(MugilsoiuyBasilewsky)[5]、河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)[23]、暗斑棘蓋太陽魚(Pomoxisnigromaeulatus)[24]鱗片最早出現(xiàn)于尾柄側(cè)中央至體側(cè)中央的連線上，又如烏鱧(Channaagrus)[25]出現(xiàn)在頭頂部，條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[26]出現(xiàn)在鰓蓋后緣至胸鰭基部，黑鯛(Sparusmacroeephlus)[27]出現(xiàn)在胸鰭基部至肛門直上方的側(cè)線處。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴和斑馬魚鱗片起始中心數(shù)量均只有1個(gè)起始中心。與草魚、鰱、鯉、鳙、尼羅羅非魚[11]、莫桑比克羅非魚[21]、河川沙塘鱧(O.potamophila)[23]、小孔亞口魚[8]、奧克蘭鰻鱺[22]、大鰻鱺[22]、黑鯛[27]鱗片起始中心數(shù)量一致。澳大利亞虎鯊(Heterodontusportusjacksoni)[28]有2個(gè)，梭魚[5]、暗斑棘蓋太陽魚[24]、條石鯛[26]有3個(gè)，烏鱧[22]有4個(gè)，重口裂腹魚[19]和齊口裂腹魚[20]有6個(gè)。

由此可見魚類鱗片的起始位置以及起始中心數(shù)量在不同魚類中差異明顯，即便是同科的團(tuán)頭魴和斑馬魚的鱗片起始位置和覆蓋方式均有很大差異。嚴(yán)太明等[19-20]指出魚類鱗片起始位置在物種間差異較大，具有種屬特異性；但是鱗片起始位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，不同物種差異較大，規(guī)律性不強(qiáng)。

3.2 魚類鱗片的覆蓋與生長(zhǎng)

利用鱗片覆蓋率來描述鱗片覆蓋的程度。對(duì)于鱗片較小、數(shù)目不清楚的魚類，如鰱、鯉、烏鯉、鳙等，習(xí)慣用鱗片覆蓋面積來進(jìn)行覆蓋率的描述。但對(duì)于鱗片較大、數(shù)目清楚的魚類，如草魚、梭魚等，經(jīng)常用鱗片出現(xiàn)的排數(shù)來描述覆蓋程度。本研究中的實(shí)驗(yàn)對(duì)象團(tuán)頭魴和斑馬魚的鱗片均清晰明了，故采用后一種方法來對(duì)鱗片的覆蓋程度進(jìn)行描述比較。

諸多研究結(jié)果表明，魚類鱗片的發(fā)生與魚類的生長(zhǎng)存在密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)中團(tuán)頭魴、斑馬魚的體長(zhǎng)和日齡與鱗片覆蓋率均有重要影響，但相比之下體長(zhǎng)與鱗片覆蓋率的相關(guān)性更強(qiáng)。這與已有研究結(jié)果一致。李思發(fā)[11]對(duì)鯉、草魚、鰱、鳙和尼羅羅非魚的研究結(jié)果表明，這幾種魚類的鱗片發(fā)育主要決定于體長(zhǎng)，體長(zhǎng)越長(zhǎng)，鱗片越多。對(duì)重口裂腹魚[19]、齊口裂腹魚[20]鱗片的研究結(jié)果表明，體長(zhǎng)和日齡對(duì)鱗片的覆蓋率均具有重要影響。這些研究結(jié)果說明了魚類鱗片發(fā)育過程可能與體長(zhǎng)、日齡有一定關(guān)聯(lián)。在魚類的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，環(huán)境因子存在不可忽視的作用，同樣作為魚類生長(zhǎng)發(fā)育的一部分，鱗片的形成也受到環(huán)境因素的影響[26]，比如餌料、水溫、密度大小等。

3.3 鱗片發(fā)生組織學(xué)研究

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)團(tuán)頭魴、斑馬魚皮膚切片染色的觀察發(fā)現(xiàn)。兩者與其他真骨魚類骨鱗的發(fā)生并無很大差別，均要經(jīng)歷真皮基質(zhì)的形成，鱗片的乳突的出現(xiàn)、鱗囊的分化和基質(zhì)沉積的過程[2，19]。這表明，不同魚類鱗片發(fā)生的起始位置、覆蓋方式差異明顯，但鱗片發(fā)育的組織學(xué)過程基本一致。由于魚類真皮和表皮中富含結(jié)締組織和膠原纖維，本研究中對(duì)皮膚組織切片不僅運(yùn)用了傳統(tǒng)的HE染色，還運(yùn)用了對(duì)膠原纖維具有良好顯色效果的Masson染色。通過兩種顯色結(jié)果的比較，從而更準(zhǔn)確地觀察到團(tuán)頭魴和斑馬魚鱗片發(fā)生的組織學(xué)過程。這也為以后利用模式生物從分子水平研究魚類鱗片發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。