廖 艷，陳 譜，廖維甲,3*

(1.桂林市疾病控制中心，廣西 桂林541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科實驗室，廣西 桂林541001；3.廣西肝損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西 桂林541001)

隨著高通量測序及生物信息學(xué)等領(lǐng)域快速發(fā)展，越來越多的環(huán)形RNA(CircRNA)在生物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。CircRNAs具有microRNA(miRNA)“海綿作用”、調(diào)控親本基因表達(dá)、與蛋白質(zhì)相互作用及翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮效應(yīng)等重要的生物學(xué)功能。近幾年來，其在包括肝細(xì)胞癌(肝癌)在內(nèi)的腫瘤中的作用被人們所重視及研究，本文旨在結(jié)合國內(nèi)外目前的研究報道，對CircRNAs在肝癌中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并探討其在臨床應(yīng)用中可能的潛在價值。

環(huán)形RNA(circular RNA,CircRNA)是一類不具有5’末端帽子和3’末端Poly(A)尾巴，由非經(jīng)典剪接方式進(jìn)行反向剪接，以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[1,2]。廣泛存在于人體及動植物細(xì)胞中，并參與多種生物過程。因其呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解[3]。

肝細(xì)胞癌(肝癌)是肝臟惡性腫瘤常見類型，它是全球范圍內(nèi)最常見、且死亡率極高的惡性腫瘤之一，具有一定的地區(qū)分布特性，在亞洲、非洲和歐洲南部等為高發(fā)區(qū)。由于病毒性肝炎感染、酗酒和肥胖等因素的影響，全球肝癌的發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升趨勢[4]。資料顯示，肝癌預(yù)后普遍不佳，其術(shù)后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%-70%[5,6]；另一方面，臨床上仍然缺乏可靠的早期診斷及預(yù)后預(yù)測的指標(biāo)和措施。目前，血清甲胎蛋白(AFP)值仍然是肝癌早期診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測常用的有效指標(biāo)，但存在明顯的敏感性與特異性不足，而不能滿足臨床需要。有研究提示，血清AFP對小肝癌基本上沒有診斷及預(yù)后監(jiān)測價值[7]，因而，迫切需要新的、更理想的標(biāo)記物來改善目前對肝癌病人早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后預(yù)測能力[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CircRNAs具有疾病特異性、組織特異性、穩(wěn)定等特性，且在血漿中含量豐富，這使得CircRNAs可能在作為疾病的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)等方面具有天然優(yōu)勢。部分CircRNAs影響著肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并呈現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。本文旨在結(jié)合目前的研究報道，重點針對CircRNAs在肝癌中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 CircRNAs的分類

根據(jù)其來源不同可大致將CircRNAs分成4種類型：外顯子CircRNAs(ecircRNAs)、內(nèi)含子CircRNAs(ciRNAs)、外顯子-內(nèi)含子CircRNAs(EIciRNAs)和轉(zhuǎn)運RNAs內(nèi)含子CircRNAs(tricRNAs)，占絕大部分的是外顯子來源的ecircRNAs[9]。ecircRNAs一般是由pre-mRNA的內(nèi)含子序列形成堿基互補配對形成，或由RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,RBP)介導(dǎo)的內(nèi)含子配對出現(xiàn)后進(jìn)行反向剪接形成[10]；ciRNAs則主要是由pre-mRNA內(nèi)含子配對后進(jìn)行反向剪接形成，或是由經(jīng)典剪接途徑將內(nèi)含子剪切后，其下游5’ 端剪接位點進(jìn)攻上游3’ 端剪接位點形成內(nèi)含子套索形成[11]；EIciRNAs一般是通過RBP介導(dǎo)或非RBP介導(dǎo)的內(nèi)含子配對后的環(huán)化作用形成[12]；而tricRNAs則是通過tRNAs剪接內(nèi)切酶復(fù)合體在凸起-螺旋-凸起(bulge-helix-bulge,BHB)位點切割含有內(nèi)含子的前體tRNAs(pre-tRNAs)后內(nèi)含子的末端連接形成，外顯子部分則連接形成成熟的tRNAs[13]。

2 CircRNAs在疾病中的作用與功能

2.1 CircRNAs具有microRNA(miRNA)“海綿作用”

microRNAs(miRNAs)是一類約22 nt大小的非編碼RNA，能夠通過直接與mRNAs的3’-UTR結(jié)合，對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14]。CircRNAs中外顯子來源的ecircRNAs可作為miRNA海綿，通過其多個串聯(lián)的結(jié)合位點吸附特定的miRNAs來影響調(diào)節(jié)miRNAs的活性[15]。

2.2 CircRNAs可調(diào)控親本基因的表達(dá)

外顯子來源的CircRNAs在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而內(nèi)含子來源的CircRNAs(如ciRNAs和EIciRNAs)大多位于細(xì)胞核中，執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控順式元件的功能。抑制ciRNAs的表達(dá)能夠?qū)е缕溆H本基因表達(dá)下調(diào)[16，17]。

2.3 CircRNAs與蛋白質(zhì)相互作用和翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮效應(yīng)

CircRNAs可直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，也可通過RNA介導(dǎo)間接與蛋白質(zhì)發(fā)生關(guān)聯(lián)，影響蛋白質(zhì)功能[18]。例如，Circ-Amotl1能與c-myc、STAT3、PDK1和AKT1等蛋白互作，并通過促進(jìn)這些蛋白的核轉(zhuǎn)位來影響其靶基因的表達(dá)[19-21]；有研究表明，包含有完整開放閱讀框(ORF)的內(nèi)源性CircRNA，Circ-ZNF609在肌生成過程中能通過剪接依賴和帽獨立的方式被翻譯成蛋白質(zhì)并發(fā)揮效應(yīng)[22]。

2.4 其他

除以上作用與功能外，CircRNAs還是pre-mRNA的調(diào)節(jié)劑，CircRNAs還可以作為RBP海綿，它在腫瘤免疫和免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要的作用等[23]。

3 CircRNAs在肝癌中的研究現(xiàn)狀

目前，CircRNAs作為miRNA分子海綿在肝癌研究中報道的不多。其中，在肝癌中上調(diào)的主要有：CiRS-7、Circ_0067934、CircRNA_100338和Hsa_circ_00005075等幾個。CiRS-7是包括腫瘤在內(nèi)的人類疾病中目前報道較多的一個CircRNA。CiRS-7主要是作為海綿，抑制miR-7活性并與miR-7競爭結(jié)合其他RNA(包括mRNA和lncRNA)[16,24]，解除或減輕miR-7對致癌分子(諸如IRS-1、IRS-2、Pakl和Rafl等)抑制作用，導(dǎo)致致癌分子表達(dá)量增加，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。而在肝癌中也存在類似的情況，高表達(dá)CiRS-7促進(jìn)肝癌細(xì)胞的微血管侵犯，并通過miR-7對下游靶分子p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)和PIK3CD的調(diào)控發(fā)揮作用[25]。Circ_0067934則是通過抑制miR-1324和FZD5/Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路激活來增強肝癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[26]。CircRNA_100338的肝癌患者有不良的預(yù)后、容易發(fā)生轉(zhuǎn)移等，其機制是CircRNA_100338作為miR-141-3p分子海綿，影響肝癌細(xì)胞的侵襲性[27]；而Shang等[28]發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_00005075表達(dá)上調(diào)水平與腫瘤大小正相關(guān)，受其作用的miRNAs包括 miR-23b-5p、miR-93-3p、miR-581和miR-23a-5p等。

在肝癌中下調(diào)的主要有：CircMTO1、Hsa_circ_0001649、Hsa_circ_0004018、circZKSCAN1、cSMARCA5等幾個。Han等[29]發(fā)現(xiàn)CircMTO1(Hsa_circRNA_0007874/Hsa_circRNA_104135)與肝癌患者生存期和預(yù)后密切相關(guān)，其機制是CircMTO1作為miR-9的分子海綿，靶向結(jié)合miR-9并上調(diào)受miR-9調(diào)控的p21的表達(dá)，繼而抑制肝癌細(xì)胞的生長與侵襲；Qin等[30]則發(fā)現(xiàn)Hsa_circ_0001649表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)。而Hsa_circ_0004018的低表達(dá)與AFP水平，腫瘤大小，組織分化，巴塞羅那分期(BCLC)和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期等相關(guān)，作用的miRNAs包括 miR-30e-5p、miR-647、miR-92a-1-5p、miR-660-3p和miR-626等[31]。此外，Yao等[32]發(fā)現(xiàn)沉默circZKSCAN1能促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，相反地，過表達(dá)則能抑制肝癌進(jìn)展。CircZKSCAN1則參與幾個癌癥相關(guān)的信號通路的調(diào)控，它們相互合作以抑制肝癌的生長，遷移和侵襲；Yu等[33]則發(fā)現(xiàn)cSMARCA5下調(diào)水平與肝癌細(xì)胞侵襲性特征顯著相關(guān)，且為肝癌患者術(shù)后總體生存率(OS)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)的獨立危險因素，其機制為cSMARCA5可以通過結(jié)合miR-17-3p和miR-181b-5p促進(jìn)腫瘤抑制因子(TIMP3)的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。

除了分子海綿功能外，CircRNAs還具有一定的蛋白調(diào)控功能。Li等[34]通過GREAT將候選CircRNAs與蛋白質(zhì)編碼基因(PCG)相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)與這些候選CircRNAs相關(guān)的PCG在正常和腫瘤樣品之間具有差異性表達(dá)模式。這些PCG主要富集肝臟、心血管相關(guān)疾病，如動脈粥樣硬化，心肌缺血和冠心病，并參與各種代謝過程。進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)分析表明，這些PCGs在監(jiān)管和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)中起著重要的作用。分別利用候選的CircRNAs及其相關(guān)基因建立了區(qū)分正常和腫瘤樣本的分類模型。結(jié)果表明CircRNAs可能是肝癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，為探索肝癌的發(fā)病機制提供了有用的資源。另有研究，Yang等[35]發(fā)現(xiàn)小腦變性相關(guān)蛋白1反義RNA(CDR1as)，一種致癌性CircRNA，在肝癌細(xì)胞中找到了增強CDR1as表達(dá)的330個差異表達(dá)蛋白(DEP)，表明它們可能是由CDR1as調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，CDR1as至少部分通過調(diào)節(jié)EGFR表達(dá)發(fā)揮其對細(xì)胞增殖的作用。此外，又進(jìn)一步證實CDR1as可以抑制miR-7的表達(dá)。鑒于EGFR是miR-7的有效靶點，因而，CDR1as可能通過在肝癌細(xì)胞中靶向miR-7調(diào)節(jié)EGFR表達(dá)來發(fā)揮其功能。這項研究作為細(xì)胞中CircRNA-調(diào)節(jié)蛋白的有效方法得到驗證。

CircRNAs也可以通過影響一些細(xì)胞的生物學(xué)功能來影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)與CD90- 細(xì)胞相比，從SKHep1細(xì)胞中分離出來的CD90+細(xì)胞具有更高生存能力、遷移能力和侵襲能力，進(jìn)而采用微陣列檢測CD90+ 和CD90- 細(xì)胞的CircRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中之一Hsa_circ_0067531表達(dá)水平不同；而在肝癌組織中hsa_circ_0067531的表達(dá)與相鄰正常組織相比明顯降低。這提示Hsa_circ_0067531可能是通過影響CD90+ 肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，來影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

此外，肝癌的特點之一是發(fā)病率存在明顯的性別差異，雄激素受體(AR)被認(rèn)為在其中起到關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)AR可以結(jié)合到RNA編輯酶ADAR1的啟動子區(qū)上調(diào)ADAR1 p110的轉(zhuǎn)錄，從而抑制CircRNAs的表達(dá)。如，CircARSP91(Hsa_circ_0085154)是受AR-ADAR1調(diào)控導(dǎo)致下調(diào)的CircRNA，并體內(nèi)、外實驗證實能抑制肝癌細(xì)胞的生長。這些研究結(jié)果表明，AR可以通過調(diào)控ADAR1的表達(dá)，從而抑制CircRNAs表達(dá)，影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[37]。

4 CircRNAs在肝癌中的研究展望與存在的問題

4.1 一種新型的生物標(biāo)記物

上述相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，某些CircRNAs可能是肝癌診斷、預(yù)后預(yù)測和治療等重要相關(guān)的、潛在的新型生物標(biāo)記物和靶點。CircRNAs作為一種生物體內(nèi)含量豐富、穩(wěn)定、保守和結(jié)構(gòu)多樣等，基于其首尾相接成環(huán)的結(jié)構(gòu)特點，不易被RNA酶等核酸酶降解，這些都提示circRNA在諸多的生埋、病理過程中可能具有重要的生物學(xué)功能，有望在疾病診斷和治療中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

4.2 為肝癌的研究治療開辟新道路

雖然CircRNAs在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的很多機制和功能還不明確，但已經(jīng)有部分研究顯示，CircRNAs可通過miRNA分子海綿功能，蛋白調(diào)控功能，和影響一些細(xì)胞生物學(xué)功能等方式來影響肝癌的發(fā)生或發(fā)展。那么，我們不僅可把其作為生物標(biāo)記物來監(jiān)測，也可以反過來改變其表達(dá)來對肝癌的發(fā)生或發(fā)展進(jìn)行干預(yù)。若暫時無法做到直接改變其表達(dá)，也可通過間接的方式，如AR可以通過上調(diào)ADAR1 p110來抑制CircRNAs的表達(dá)。通過這種干預(yù)，是否能為肝癌等疾病的研究治療開辟新道路。

4.3 現(xiàn)階段主要需要解決的問題

CircRNAs在疾病中的作用、功能及機制還不明確，現(xiàn)階段還有很多問題需要解決。如何精準(zhǔn)預(yù)測CircRNAs作為海綿分子所對應(yīng)的miRNAs，并通過大量準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)來驗證，以此來建立起關(guān)于CircRNAs作為miRNA海綿分子的網(wǎng)絡(luò)庫，這還有一段很長的路要走。另外CircRNAs作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控順式元件的功能，或有可能作為反式作用因子的功能，其能通過與關(guān)鍵蛋白結(jié)合來調(diào)控腫瘤發(fā)展的功能，甚至其本身都具有翻譯成蛋白或多肽的潛能等功能，值得深入研究。