葉漢杰，王立立，余丹萍，李取生，徐智敏，周 初，林 欣，呂 耀，周 婷

（暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州 510632）

Pb是一種具有蓄積性、多親和性的重金屬元素，植物吸收過多的Pb后不僅會帶來糧食減產(chǎn)[1-2]，最終會通過食物鏈危害人體健康。據(jù)我國郊區(qū)菜地土壤重金屬污染狀況研究表明我國土壤重金屬Pb污染形勢十分嚴(yán)峻[3-4]，此外相當(dāng)一部分污染土壤伴隨著土壤鹽漬化[5]和營養(yǎng)元素生物有效性低[6]等情況。人們在關(guān)注土壤中重金屬污染問題上偏重于對土壤中重金屬含量和形態(tài)的關(guān)注，而忽視了土壤中其他因素對植物吸收累積重金屬元素可能帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。研究報(bào)道，部分污染土壤鹽漬化[7-8]和Zn、Fe元素缺乏[9-10]以及Ca元素吸收受到抑制[11]都會影響植物對重金屬的吸收，但目前為止，這類工作大多數(shù)僅限于對重金屬Cd的研究，而同樣對農(nóng)產(chǎn)品安全造成嚴(yán)重威脅的重金屬Pb卻鮮有報(bào)道。

Pb是植物體內(nèi)非必需元素，主要通過必需金屬元素的運(yùn)輸?shù)鞍走M(jìn)入植物根系細(xì)胞和參與地上轉(zhuǎn)運(yùn)過程[12]，而在植物元素缺乏或過多時(shí)，會通過調(diào)控該類運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)來維持植物體內(nèi)各個(gè)部位的金屬元素平衡，同時(shí)也影響著植物對重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。余丹萍等[13]通過水培實(shí)驗(yàn)推斷鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1缺Fe/Zn環(huán)境下的高表達(dá)增加了白梗尖葉莧菜對重金屬的吸收累積。李楠[14]發(fā)現(xiàn)大豆在Cd脅迫下會降低二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nramp5的表達(dá)來減少對Cd的吸收。目前為止研究者通過異源表達(dá)，基因沉默和過表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)分離并鑒定出與Pb吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的運(yùn)輸?shù)鞍子蠥tHMA3[15]、NtLCT1[16]、OsH?MA9[17]、AtPDR12[18]、AtCNGC1[19]和 NtCBP4[20]，其 中AtHMA3定位在液泡膜上，將Pb區(qū)隔于液泡中；NtLCT1、AtCNGC1和NtCBP4定位在質(zhì)膜上，轉(zhuǎn)運(yùn)Pb2+至細(xì)胞質(zhì)中；OsHMA9、AtPDR12定位在質(zhì)膜上，將Pb2+排出至根際。上述研究基本停留在功能鑒定階段，而關(guān)于調(diào)控這些蛋白的基因在不同環(huán)境下的響應(yīng)與Pb的吸收累積關(guān)系則鮮有報(bào)道。將上述基因序列在 NCBI番茄基因庫[Lycopersicon esculentum（taxid：4081）]中進(jìn)行同源性比對，僅獲得AtCNGC1和NtCBP4的同源基因CNGC1以及AtHMA3的同源基因HMA3。研究這兩個(gè)基因的表達(dá)與Pb吸收累積的關(guān)系對揭示不同環(huán)境下植物吸收累積Pb的分子機(jī)理具有重要意義。

綜上，通過分析不同脅迫下對植物吸收累積Pb的影響與CNGC1和HMA3基因表達(dá)的關(guān)系，探究蔬菜植物對Pb分子吸收累積規(guī)律，揭示不同脅迫下蔬菜植物對Pb的吸收累積機(jī)制，對相應(yīng)環(huán)境下農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要意義。因此，不同脅迫環(huán)境下植物對Pb吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是值得研究的課題。

至今為止，番茄是少有的已經(jīng)完成全基因組測序的蔬菜模式植物，選擇番茄作為研究對象，為進(jìn)一步的分子機(jī)理驗(yàn)證提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇臺灣黃圣女品種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，供試種子購于廣州市場。白沙購于河源市英川有限責(zé)任公司。

Hoagland 營養(yǎng)液含量為 4.0 mmol·L-1Ca（NO3）2·4H2O，2.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O，5 mmol·L-1KNO3，1 mmol·L-1NH4NO3，1.0 mmol·L-1KH2PO4，0.132 mmol·L-1MnSO4·4H2O，0.1 mmol·L-1H3BO3，0.03 mmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.1 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.1 μmol·L-1CoCl2，1.0 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O，5.0 μmol·L-1KI和0.1 mmol·L-1EDTA·FeNa[21]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將洗凈經(jīng)滅菌的白沙鋪滿在育苗板后放置于塑料框中，供試種子經(jīng)30%雙氧水浸泡10 min消毒后用去離子水沖洗數(shù)次，并播種于育苗板中。4 d后開始在塑料框中澆灌30%的Hoagland營養(yǎng)液；3周后選取長勢均勻的番茄幼苗移于水培盆中，經(jīng)9 d的100%霍格蘭德營養(yǎng)液穩(wěn)定培養(yǎng)后，其中每3 d更換1次營養(yǎng)液，選取長勢均勻的番茄植株開始進(jìn)行處理，共3個(gè)處理。缺Ca：全營養(yǎng)液缺Ca（全營養(yǎng)液中不添加Ca元素）+Pb；缺Fe：全營養(yǎng)液缺Fe（全營養(yǎng)液中不添加Fe元素）+Pb；加鹽：全營養(yǎng)液+NaCl+Pb；全液：全營養(yǎng)液+Pb。其中全液為對照組，其余3組為實(shí)驗(yàn)組，Pb以Pb（NO3）2的形式加入，Pb濃度設(shè)置為 0.5 μmol·L-1，鹽分濃度為0.3%氯化鈉。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每3 d更換1次營養(yǎng)液并持續(xù)曝氣，7 d處理后收獲植物。

1.3 樣品預(yù)處理及測定方法

收獲的植物樣品用去離子水洗凈，并用剪刀把莖葉和根部分開，取部分根尖的鮮樣經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，根部經(jīng)10 mmol·L-1EDTA·Na2浸泡超聲洗滌5 min，并重復(fù)3次，以除去細(xì)胞壁所吸附Pb等金屬元素，莖葉和根部分別用信封包好放置于60℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。將烘干的組織樣經(jīng)人工研磨至粉末狀后，稱取0.1～0.3 g于消解罐中，加入10 mL優(yōu)級純硝酸進(jìn)行微波消解（CEM corporation，MARS5），經(jīng)中速濾紙過濾后，用于測定Pb、Ca、Na等金屬元素的含量。元素測定使用等離子體發(fā)射光譜儀（美國PE公司，OPTIMA2000DV）測定。

使用NRAiso Plus Trizol試劑（寶生物公司）提取植物根尖總RNA并通過凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性，經(jīng)gDNA Erase處理去除基因組，用PrimeScript RT reagent Kit cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物公司）合成cDNA第一條鏈，并以Actin作為內(nèi)參基因[22]，以全液處理組作為對照組，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BioRad，CFX96）測定 CNGC1和 HMA3基因的相對表達(dá)水平。引物根據(jù)番茄CNGC1（NCBI Gen?Bank：LOC101244669）基因、HMA3（NCBI GenBank：XP_010323360）基 因 和 Actin（NCBI GenBank：LOC101262163）基因的序列設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成，采用PAGE純化方式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方差分析以及顯著性差異分析，顯著性差異分析選用Duncan統(tǒng)計(jì)方法。

為了評價(jià)根部Pb吸收能力和Pb地上轉(zhuǎn)運(yùn)能力的大小，分別用單位質(zhì)量根Pb凈吸收量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來表示：

單位質(zhì)量根Pb凈吸收量（μg·g-1）=平均每株植物Pb凈吸收總量（μg）/平均每株根干質(zhì)量（g）

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=植株地上部Pb含量（mg·kg-1）/植株地下部Pb含量（mg·kg-1）

CNGC1活性水平=CNGC1相對表達(dá)量/根部Ca含量

2 結(jié)果與分析

2.1 缺Ca/Fe及鹽分脅迫對植物Pb富集及生物量的影響

缺Ca/Fe及鹽分脅迫對植物生物量的影響主要在莖葉部分（表1），與對照組相比，分別下降了24.8%、10.7%、22.7%；缺Ca處理下根部生物量下降了21.9%，其他處理均無顯著性差異。三種處理下植物對Pb富集呈現(xiàn)不同的規(guī)律，其中缺Ca處理下，與對照組相比較，根部Pb元素增加了60.6%，而莖葉中Pb下降了26.6%；缺Fe處理下，與對照組相比較，根部Pb元素下降了22.8%，而莖葉中Pb增加了50%；鹽分脅迫下，根部Pb元素與對照組無顯著差異，但莖葉Pb含量較對照組增加了203.1%。

2.2 缺Ca/Fe及鹽分脅迫下對植物單位質(zhì)量根Pb凈吸收量及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

如圖1（a）可見，缺Ca及鹽分脅迫下，植物單位質(zhì)量根Pb吸收能力較對照組均有顯著提高，其單位質(zhì)量根Pb凈吸收量分別增加了46.9%和31.0%。而缺Fe脅迫下，植物單位質(zhì)量根Pb凈吸收量有所下降，但未達(dá)到顯著水平。

由圖1（b）可知，Pb主要富集在根部，番茄對Pb的轉(zhuǎn)運(yùn)能力比較低，不同處理下其轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在1.29%～7.86%之間，其中缺Ca處理植物的Pb轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最小，較對照組下降了52.5%；缺Fe及鹽分脅迫下，植物的Pb轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯著增大，分別增加了109.4%和190.1%。

2.3 缺Ca/Fe及鹽分脅迫對番茄其他金屬元素的影響

由表2可知，缺Ca條件下，根部Ca含量較對照組并無顯著性差異，而莖葉部分Ca含量則顯著低于對照組，莖葉中Ca含量較對照組下降了54.26%。鹽分脅迫下，植物根部Ca含量下降了39.0%，顯著低于對照組，莖葉部分鈣含量則與對照組無顯著性差異。鹽分脅迫下，植物體內(nèi)Na+含量較對照組顯著增加，其中根部增加了148.5%，莖葉中增加了約20倍。

2.4 缺Ca/Fe及鹽分脅迫下對根部關(guān)鍵基因的表達(dá)影響

由圖2可知，不同脅迫條件會引起植物根部相關(guān)基因差異表達(dá)。其中CNGC1基因的表達(dá)量在缺鈣處理下，較對照組顯著上調(diào)了150%，鹽分脅迫下CNGC1表達(dá)量雖有所下調(diào)，但未達(dá)到顯著性差異；根部HMA3基因的表達(dá)量在缺鈣處理下較對照組顯著上調(diào)70%，而在缺鐵及鹽分脅迫下，則較對照組下調(diào)了65%和50%。

表1 不同處理下植物Pb富集及生物量Table 1 Enrichment and biomass of plant Pb under different treatments

圖1 不同處理下番茄單位質(zhì)量根Pb凈吸收量（a）和Pb地上轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（b）Figure 1 Pb uptake by per unit root mass（a）and Pb translocation factor（b）in tomato under different treatments

表2 番茄莖葉和根部金屬元素的含量（mg·kg-1干質(zhì)量）Table 2 Content of mineral elements in shoot and roots of tomato（mg·kg-1DW）

圖2 不同處理下植物根部CNGC1和HMA3的相對表達(dá)量Figure 2 Relative expression of CNGC1 and HMA3 in plant roots under different treatments

2.5 缺Ca/Fe及鹽分脅迫下番茄Pb吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與關(guān)鍵基因表達(dá)的相關(guān)性分析

由表3可知，不同處理下番茄根部單位質(zhì)量Pb凈吸收量與CNGC1活性水平呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；番茄Pb轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)與HMA3的表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），CNGC1活性水平與HMA3的表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論

植物根系通過質(zhì)外體和共質(zhì)體兩種途徑吸收外界環(huán)境中有效態(tài)的毒性元素[23-24]。因以被動吸收為機(jī)制的質(zhì)外體途徑受到內(nèi)、外皮層細(xì)胞形成的凱氏帶屏障的限制[25]，使得以主動吸收為機(jī)制的共質(zhì)體途徑成為了最主要的吸收方式。共質(zhì)體吸收途徑包括離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和內(nèi)吞作用三種方式，其中以前兩者為主。因而研究Pb通道蛋白基因的表達(dá)與Pb吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系，對全面掌握蔬菜Pb吸收累積規(guī)律，發(fā)展綠色蔬菜，保障人類健康具有重要意義。

表3 不同處理下番茄相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of tomato related indexes under different treatments

CNGC離子通道，定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，其核心由6個(gè)α-螺旋跨膜區(qū)和CNBD結(jié)合域組成，因其通道的“門”受到環(huán)核苷酸（正調(diào)控）和Ca調(diào)素調(diào)控（負(fù)調(diào)控），該離子通道被命名為環(huán)核苷酸Ca調(diào)素門控非選擇性陽離子通道[26]。故該離子通道運(yùn)輸金屬離子的能力不僅受到表達(dá)量的影響，還受到了細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸和鈣調(diào)素作用的影響，而其中Ca調(diào)素起著主要的調(diào)控作用。研究報(bào)道，細(xì)胞中過高的Ca濃度會激活Ca調(diào)素并與環(huán)核苷酸競爭CNGC離子通道的CNBD結(jié)合域，阻礙了該通道“門”的打開，從而降低了該蛋白對金屬離子的跨膜運(yùn)輸能力[27]。因此引入CNGC1離子通道活性水平來表示CNGC離子通道在根部細(xì)胞中運(yùn)輸金屬離子能力的大小。目前為止CNGC家族在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20個(gè)家族成員，其功能大多數(shù)已經(jīng)被分離鑒定，在抗病、花粉管生長、對Ca2+響應(yīng)、抵抗重金屬離子毒害和抗鹽等多種信號中發(fā)揮著重要作用[28]。其中AtCNGC1離子通道被鑒定出與Pb、Ni元素的吸收相關(guān)[19]。本次試驗(yàn)，通過同源性比獲得了番茄中AtCNGC1的同源基因CNGC1，并分析了缺Ca/Fe及鹽分脅迫下植物根部Pb吸收能力與植物根部CNGC1離子通道活性水平的關(guān)系，結(jié)果顯示，不同脅迫處理下，植物根部Pb吸收能力與CNGC1活性水平呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），推測CNGC1離子通道活性的增加促進(jìn)了植物對Pb的吸收。但CNGC1離子通道并不是植物吸收Pb唯一運(yùn)輸?shù)鞍?，Sunkar等[19]在擬南芥中通過T-DNA插入技術(shù)，獲得了AtCNGC1缺失植株，結(jié)果顯示AtCNGC1缺失植株吸收Pb較對照組顯著下降，但下降幅度不超過50%。故筆者認(rèn)為，缺Ca/Fe及鹽分脅迫下，CNGC1離子通道在番茄的Pb吸收過程起著重要作用。

HMA又稱P1B-ATPase，重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，屬于運(yùn)輸?shù)鞍字械碾x子泵，它既能選擇性地輸入和泵出植物必需的金屬離子，也能轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子，它能夠通過水解ATP獲得能量，為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)陽離子提供能量，該家族成員在植物抗逆機(jī)制中起著重要作用[29]。余剛[30]發(fā)現(xiàn)對四翅濱藜進(jìn)行重金屬（Fe、Cu、Ni、Cd和Pb），PEG6000和NaHCO3等脅迫處理可高度誘導(dǎo)四翅濱藜中AcHMA1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，但是低溫和NaCl脅迫使四翅濱藜中AcHMA1的表達(dá)受到抑制。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中過表達(dá)AcHMA1能夠顯著增加酵母細(xì)胞對過量Fe離子的抗性。AcHMA1同時(shí)也對提高酵母細(xì)胞應(yīng)對鹽、堿、干旱和氧脅迫等脅迫的能力起到重要作用，其中AtHMA3被鑒定出參與Pb區(qū)隔過程[15]。本次試驗(yàn)中，番茄根部HMA3在缺Ca條件下被誘導(dǎo)高表達(dá)，增強(qiáng)了Pb區(qū)隔于液泡中的能力，從而阻礙了Pb往地上轉(zhuǎn)運(yùn)；缺Fe及鹽分脅迫下，HMA3在根部的表達(dá)受到抑制，降低了根部細(xì)胞對Pb的區(qū)隔能力，間接地增強(qiáng)了Pb地上轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，從而促進(jìn)了植物地上部Pb的累積。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鹽分脅迫較缺Fe處理Pb轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)，這可能是由于細(xì)胞中Pb的遷移性增強(qiáng)導(dǎo)致的結(jié)果，侯曉龍等[31]通過透射電子顯微鏡（TEM）發(fā)現(xiàn)Pb進(jìn)入到植物根部細(xì)胞后，會以難溶態(tài)形式聚集在液泡膜表面，降低了Pb在胞內(nèi)的可遷移性，阻礙了Pb木質(zhì)部裝載過程。徐劼等[32]通過化學(xué)試劑逐步提取法，提取不同處理茶樹根中各種形態(tài)的Pb含量，各個(gè)處理中的氯化鈉提取態(tài)僅次于鹽酸提取態(tài)，占了Pb總量的34.7%～41.4%，其結(jié)果表明氯化鈉溶液會增加Pb的遷移性。當(dāng)植物受鹽分脅迫時(shí)，大量的Cl-進(jìn)入到根系細(xì)胞體內(nèi)與Pb形成[PbCl4]2-可遷移態(tài)絡(luò)合物[33]，增加了Pb在根部細(xì)胞內(nèi)的遷移性，使更多的Pb可以參與木質(zhì)部的裝載過程，從而促進(jìn)Pb的地上轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 結(jié)論

（1）缺Ca脅迫更容易導(dǎo)致Pb在根部的累積，缺Fe脅迫促進(jìn)Pb往地上部累積，而鹽分脅迫顯著增強(qiáng)了Pb在不同組織中的含量。

（2）缺Ca及鹽分脅迫顯著增強(qiáng)了根對Pb的吸收能力，而缺Fe脅迫則表現(xiàn)出了顯著的抑制效應(yīng)。

（3）HMA3離子泵的高表達(dá)導(dǎo)致更多Pb轉(zhuǎn)入根部液泡中，從而顯著抑制其往地上部轉(zhuǎn)運(yùn)過程。CNGC1離子通道的高表達(dá)顯著促進(jìn)Pb的根部吸收過程，且CNGC1的活性受細(xì)胞內(nèi)的Ca濃度負(fù)調(diào)控。