馬舒坦，顏曉元

（1.中國科學(xué)院南京土壤研究所，土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京 210008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

N2O是一種重要的溫室氣體，大氣中的N2O濃度已由工業(yè)革命前的～270 ppbv增加到～320 ppbv，其增加量主要來自于人類的農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)活動，其中農(nóng)田土壤中氮肥施用產(chǎn)生的N2O約占人為源的40%～60%[1]。進入到大氣中的N2O非常穩(wěn)定，其存留時間可以長達120 a，其主要去向在大氣平流層光解而消耗臭氧，這也使得N2O成為了臭氧層的主要破壞者[2-3]。全面深入地理解N2O產(chǎn)生過程是我們準(zhǔn)確估算其產(chǎn)生量和制定減排措施的基礎(chǔ)。

微生物的反硝化過程是N2O的最重要來源，反硝化過程產(chǎn)生的N2O約占全球農(nóng)業(yè)的60%[4]。微生物反硝化是指在缺氧或厭氧條件下異養(yǎng)微生物將硝酸鹽或者亞硝酸鹽逐步還原為N2O和N2的過程。這是一個異養(yǎng)過程，有機碳源分解中產(chǎn)生電子被接受而發(fā)生還原反應(yīng)。但以往的研究中主要關(guān)注的影響因素包括土壤含水量、土壤通氣性、土壤溫度、土壤pH和氮肥的種類等[5-9]。對于有機碳的研究，研究人員通常在土壤中添加大量的有機物料[10-12]，往往忽視了在實際野外條件下植物根系分泌物的影響。根系分泌物一些特點也增加了研究的困難：例如種類繁多，包括各種氨基酸、有機酸、糖類等各種小分子物質(zhì)，以及脂肪、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì)[13-14]；此外土壤中單一種類的有機碳含量非常少（＜1 μmol C·g-1）[15]。盡管如此，有研究表明，根系分泌物可以顯著地影響到土壤中N2O的排放。Henry等向土壤中添加了不同組分的有機小分子（150 μg C·g-1），土壤產(chǎn)N2O潛勢是對照組的8～11倍，而土壤中的微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化[16]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有機碳源的種類也會影響土壤N2O的還原過程[17-18]。最近，Guyonnet等發(fā)現(xiàn)土壤N2O的產(chǎn)生量與根際土壤中丁酸和琥珀酸的相對含量呈正相關(guān)而與木糖的含量呈負(fù)相關(guān)[19]。

以上的研究都說明，根系分泌物可以顯著地影響土壤N2O的排放。然而這些研究中，單一有機碳源的添加量都比較大（＞5 μmol C·g-1）[16-18]。實際上這些小分子物質(zhì)在根系土壤中的含量是非常低的，某一種有機小分子通常不到 1 μmol C·g-1[15，20]，實驗中高量的添加外源有機物不能反映土壤中真實情況。另外，土壤中添加的有機碳源形態(tài)主要是含碳原子數(shù)2～6的有機酸，葡萄糖和其他含氮氨基酸，這些小分子多數(shù)都是可以參加到微生物體內(nèi)廣泛存在的三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），并具有相似的電子傳遞體系[21]。因此選擇這一類小分子缺乏一定的代表性。針對這兩個問題，本實驗選擇低劑量（≤1 μmol C·g-1）添加有機碳源進行室內(nèi)培養(yǎng)實驗來探究有機小分子對土壤N2O的影響。有機碳選擇了葡萄糖和甲酸鹽。葡萄糖代表以往實驗中的一般碳源，可以被大多數(shù)微生物利用；甲酸鹽是一種特殊的碳源，只能被特定的微生物利用，并且可以直接參加某些真菌反硝化的過程[22-23]。

1 材料與方法

1.1 土壤采集保存與理化性質(zhì)測定

土樣采自江蘇常熟市辛莊鎮(zhèn)（N31°32′，E120°41′），根據(jù)S點法布點，采集0～15 cm深度土壤。采樣后的鮮土過2 mm篩，置于4℃條件下保存?zhèn)溆?。其中水稻土采自常熟生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站的育秧土壤，施肥量為每年300 kg N·hm-2；菜地土壤采自當(dāng)?shù)氐拇笈锸卟说?，施肥量約每年1044 kg N·hm-2，大棚蔬菜地由水稻田改制而來，種植年限已有6年。我們的取樣時間是2017年2月17號。采樣的時候稻田處于休閑期，設(shè)施菜地處于作物生長期。菜地種植的是上海青，并且即將收獲上市。

培養(yǎng)實驗之前測定土壤理化性質(zhì)。土壤NH+4和NO-3含量測定使用全自動化學(xué)分析儀（AMS，荷蘭），測樣時，鮮土用2 mol·L-1KCl浸提，土壤和浸提液的比率是1∶5。土壤全C和全N的測定使用Vario碳氮元素分析儀（Elementar，德國），測定樣品之前，鮮土需風(fēng)干后再過100目篩。土壤粒徑的測定使用激光粒度儀（LS 13320，美國），測定樣品之前，鮮土需風(fēng)干后再過2 mm篩。土壤pH是在土壤和蒸餾水混合液中測定，土水比為1∶2.5，測定儀器是pH計（Sartorius，美國）。主要的理化性質(zhì)見表1。

表1 菜地和稻田土壤的理化性質(zhì)Table 1 The chemical properties of soils from the vegetable field and paddy soils

1.2 土壤培養(yǎng)與氣體N2O含量測定

土壤預(yù)培養(yǎng)：從4℃冰箱中取出適量土樣置于250 mL燒杯中，用封口膜（parafilm）密封，在25℃培養(yǎng)箱中預(yù)先培養(yǎng)3 d。

土壤培養(yǎng)：稱取干質(zhì)量為5 g的鮮土于120 mL的血清瓶中，另保存4～5 g鮮土于-80℃的冰箱中用于DNA提取。以溶液形式向土壤中添加不同濃度的無機氮源和有機碳源，并調(diào)節(jié)含水量至75%WHC（最大可持水量）。實驗分為兩個施氮水平（以KNO3-N計）50、250 mg·kg-1。每個施氮水平下，根據(jù)外加有機碳的含量和種類不同分為5個處理：（1）不外加碳源，（2）添加0.5 μmol甲酸鈉-C·g-1干土，（3）添加1 μmol甲酸鈉-C·g-1干土，（4）0.5 μmol葡萄糖-C·g-1干土，（5）1 μmol葡萄糖-C·g-1干土。完成溶液添加后，用鉗口鋁蓋密封血清瓶。真空泵抽真空5 min后，放入新鮮空氣，置于25℃培養(yǎng)箱，每個實驗處理有3個重復(fù)。每24 h用注射器采集氣樣，并置換血清瓶內(nèi)空氣，損失的水分通過稱重法補齊。培養(yǎng)時間為4 d。

氣體樣品的測定在采樣后24 h內(nèi)完成。使用儀器為Agilent 7890A氣相色譜儀。高純氮氣作為載氣，流速25 mL·min-1，使用不銹鋼分離柱（內(nèi)徑為2 mm，長度3 m），由Porapak Q材料（80～100目）填充分離柱，分離柱工作溫度為55℃。檢測器是電子俘獲檢測器（ECD），檢測器工作溫度為330℃。

氣體排放速率計算公式如下：

式中：F是單位質(zhì)量干土的N2O排放速率，μg N·kg-1·h-1；dc/dt為24 h內(nèi)N2O的濃度平均變化率，μL·L-1·h-1；M為N2O-N的摩爾質(zhì)量，28 g·mol-1；Vm是標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下氣體的摩爾體積，22.4 L·mol-1；V是血清瓶的有效空間體積，L；T是培養(yǎng)時的溫度，25℃；m為血清瓶中的實際干土質(zhì)量，5 g。

1.3 微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)

稱取0.5 g菜地和稻田鮮土，使用Fast DNA SPIN試劑盒（MP Biomedical，美國），根據(jù)說明書步驟提取土壤DNA。每種土壤有3個重復(fù)。提取完成后，DNA樣品分裝成3份，置于-80℃冰箱中保存，用于熒光定量PCR和高通量測序。

真菌（18S rRNA genes）、細(xì)菌（16S rRNA genes）以及反硝化細(xì)菌（nirS，nirK）的豐度由熒光定量PCR測定，所用儀器為Applied Biosystems QuantStudio 3 Real-Time PCR系統(tǒng)。真菌和細(xì)菌的引物序列和PCR反應(yīng)條件參照Wang等[24]；nirS，nirK的引物序列和PCR的反應(yīng)條件參照Rousk等[25]。具體的反應(yīng)體系（20 μL）如下：10 μL SYBR GreenⅠ熒光染料（Takara，日本），1 μL上下游引物（5 μmol·L-1），0.08 μL ROX參比染料，2 μL DNA樣品。加樣前，DNA樣品稀釋了20倍，以消除腐植酸等雜質(zhì)的影響。

高通量測序用于分析細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，測序平臺是北京諾禾致源公司的IlluminaHiSeq2500。細(xì)菌和真菌的測序區(qū)域分別是16S V4和18S ITS 1，所選的擴增引物分別為帶有識別碼的515F-806R和1373F-2043R[26-27]。PCR擴增中高保真反應(yīng)體系選用紐英倫生物公司（New England Biolabs）的PhusionRHigh-Fidelity PCR Master Mix。PCR所獲的擴增子經(jīng)過切膠純化后上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對高通量測序獲得的優(yōu)質(zhì)序列利用Uparse軟件（V7.0.1001，http：//drive5.com/uparse/）進行聚類分析，相似度為97%的序列劃歸到一個可操作分類單元中（OTUs）。使用QIIME（V1.7.0,http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）計算得到的Coverage指數(shù)（http：//www.mothur.org/wiki/Coverage）表明測序深度滿足后續(xù)分析。利用RDP分類器（V2.2，http：//source?forge.net/projects/rdp-classifier/）與GreenGene數(shù)據(jù)庫（http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）比對獲得每個細(xì)菌OTU的分類學(xué)信息。利用QIIME軟件（V1.7.0）中的Blast算法與Unite數(shù)據(jù)庫（https：//unite.ut.ee/）比對獲得每個真菌OTU的分類學(xué)信息。反硝化細(xì)菌和反硝化真菌的種類參考已發(fā)表文獻[28-29]。

使用SPSS 16.0對實驗處理間進行方差分析和多重比較。Origin 2015用于實驗作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤N2O排放速率

外源有機質(zhì)的添加可以顯著地刺激土壤中N2O的排放（圖1）。其他劑量的有機碳和無機氮添加下土壤中的N2O的排放趨勢與此類似，N2O的排放速率在24 h很快達到平穩(wěn)。從最大N2O排放速率來看，甲酸鹽的刺激效應(yīng)遠(yuǎn)大于葡萄糖，這種差異在菜地土壤中更加明顯。在添加甲酸鹽處理中，菜地最大N2O排放速率（2.16 μg N·kg-1·h-1）幾乎是稻田（1.36 μg N·kg-1·h-1）的1.6倍。然而當(dāng)添加的有機碳源變?yōu)槠咸烟呛?，菜地的最大排放速率?.06 μg N·kg-1·h-1）卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于稻田（0.33 μg N·kg-1·h-1）。當(dāng)外源有機碳消耗完畢，N2O排放趨于平穩(wěn)，菜地釋放N2O速率（0.02～0.03 μg N·kg-1·h-1）也顯著小于稻田（0.04 μg N·kg-1·h-1）。

2.2 土壤N2O累計排放量

圖1 添加甲酸鹽（A）和葡萄糖（B）土壤N2O平均排放速率Figure 1 The average N2O emission rate from soils following the addition of formate（A）or glucose（B）

圖2 添加不同濃度甲酸鹽和葡萄糖后土壤N2O累計排放量Figure 2 The cumulative emissions of N2O from soils amended with different dosage of formate or glucose

由圖2A和2B可以看出土壤N2O的累計排放量隨著甲酸鹽濃度的提高而增加；相比于稻田土壤，菜地土壤的N2O增長幅度更快，當(dāng)甲酸鹽濃度達到1 μmol C·g-1時，菜地土壤的N2O累計排放量超過了稻田土壤。而葡萄糖對N2O排放的激發(fā)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于甲酸鹽（圖2C和2D），在葡萄糖的添加下，菜地土壤的N2O累計排放量也顯著低于稻田土壤。

由圖2A與圖2B對比可以發(fā)現(xiàn)，施氮量由50 mg NO3-N·kg-1增加到250 mg NO3-N·kg-1，土壤中N2O的累計排放量并沒有明顯增加，甚至在甲酸鹽濃度為1 μmol C·g-1時，施氮量的增加導(dǎo)致了土壤中N2O的排放量減少，其中菜地土壤由54.86 μg N·kg-1減少至44.66 μg N·kg-1，稻田土壤由 42.4 μg N·kg-1降為33.61μg N·kg-1。當(dāng)添加的葡萄糖濃度為1 μmol C·g-1時，施氮的增加也沒有顯著增加土壤N2O的排放（圖2C和圖2D）。

2.3 土壤微生物數(shù)量

表2是熒光定量PCR的結(jié)果，可以看出，菜地土壤的微生物拷貝數(shù)都顯著低于稻田土壤（P＜0.01）。稻田土壤中總的細(xì)菌拷貝數(shù)（16S rRNA）是菜地土壤的4.8倍，其中反硝化細(xì)菌nirK和nirS基因是菜地土壤的6.6倍和8.2倍。相對于細(xì)菌的拷貝數(shù)，真菌（18S rRNA）在兩種土壤中數(shù)量差異相對較少，稻田土壤的真菌拷貝數(shù)是菜地土壤的3倍左右。

表2 土壤細(xì)菌（16S rRNA）、真菌（18S rRNA）和反硝化細(xì)菌（nirK&nirS）拷貝數(shù)Table 2 The copies of bacteria（16S rRNA genes），fungi（18S rRNA genes）and denitrifying bacteria（nirK&nirS genes）in soils

2.4 土壤反硝化細(xì)菌屬和反硝化真菌屬

目前在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的反硝化細(xì)菌有50多屬，高通量的測序結(jié)果顯示，本研究中的土壤含有其中的20屬（表3）。總體來說，菜地土壤中的反硝化細(xì)菌屬的相對豐度顯著高于稻田土壤（P＜0.01）。土壤中的反硝化細(xì)菌屬的相對豐度基本都在1%以下。若以相對豐度占0.5%的菌屬為優(yōu)勢屬，菜地土壤中的優(yōu)勢屬是芽孢桿菌屬（Bacillus，1.031%）和鏈霉菌屬（Streptomyces，0.896%），稻田土壤中的優(yōu)勢屬是短根瘤菌屬（Bradyrhizobium，0.803%）和鏈霉菌屬（Strepto?myces，0.568%）。

表3 土壤典型反硝化細(xì)菌屬相對豐度Table 3 The relative abundance ratios of denitrifying bacteria genus in soils

目前在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的反硝化真菌有60屬，在本研究中的土壤我們發(fā)現(xiàn)了29屬（表4）?？傮w來說，菜地土壤的反硝化真菌相對豐度顯著高于稻田土壤（P＜0.01），尤其是菜地土壤中畫線殼屬（Monographella，35.4%）和鐮刀屬（Fusarium，9.5%），分別是稻田土壤的81倍和13倍，這兩種真菌也是常見的植物致病菌。若以相對豐度占0.5%的菌屬為優(yōu)勢屬，稻田土壤中只有芽枝霉屬（Cladosporium）的相對豐度（1.316%）大于菜地土壤。

3 討論

3.1 有機碳對土壤N2O排放的刺激作用

微生物體內(nèi)的反硝化過程實際上是包括有機質(zhì)的氧化過程和NO-3的還原過程，即有機質(zhì)的氧化過程產(chǎn)生的電子被NO-3等無機氮接受。不同反硝化微生物會有不同的電子傳遞體系[29]，即使同一種反硝化微生物也會因為有機碳源的不同，電子會沿著不同的路徑傳遞[22]。因此有機碳的添加可以顯著地刺激土壤N2O的排放，刺激程度也會因為有機碳的種類不同而不同（圖1，圖2）。

表4 土壤典型反硝化真菌屬相對豐度Table 4 The relative abundance ratios of denitrifying fungi genus in soils

本研究中我們向土壤中添加了少量的葡萄糖和甲酸鹽。與葡萄糖相比，甲酸鹽對N2O的刺激作用是葡萄糖的1.7～3.38倍，這一現(xiàn)象主要與碳源的種類和土壤微生物群落有關(guān)。葡萄糖作為一種廣譜碳源可以被多種微生物利用。除了土壤中少量的反硝化微生物利用葡萄糖外，其他異養(yǎng)微生物也會與反硝化微生物競爭有限的碳源。而甲酸鹽只能被特定的微生物利用，其中包括某些反硝化真菌。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，本研究中的兩種土壤中都存在反硝化真菌（表3）。

在自然界中，植物根系分泌物是土壤有機質(zhì)的重要來源，有研究報道植物光合作用產(chǎn)物的20%都可以進入根系分泌物中[33]。因此野外條件下土壤微生物有著持續(xù)的有機質(zhì)供應(yīng)，而室內(nèi)研究一般都忽略了根系分泌物的作用，或者在研究中加入了過量單一的有機碳如葡萄糖[10-11，34]。本研究中，我們添加的外源有機碳含量接近野外條件土壤根系分泌物。雖然有機質(zhì)的添加量是微量的，但卻顯著地刺激土壤中的N2O排放，并且其排放的強度受有機碳源的種類和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。這些結(jié)果說明，在土壤培養(yǎng)實驗中，我們應(yīng)當(dāng)考慮根系分泌物對N2O排放的影響，例如，氮肥的使用是否會通過刺激植株生長進而間接地影響土壤中N2O的排放。另外，外源有機質(zhì)的添加對N2O排放的影響也是不能忽視的。例如，Xia等[35]通過數(shù)據(jù)整合分析表明，有機肥等量替代化肥后，N2O排放既可能增加也可能減少，因而有機肥施用沒有顯著的減排潛力，我們認(rèn)為這可能與土壤中有機肥的成分以及土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。對這些問題的探究有助于制定N2O減排策略。未來需要結(jié)合盆栽以及田間實驗來開展相關(guān)研究。

3.2 土壤中反硝化微生物群落大小及其對N2O排放的貢獻

利用底物誘導(dǎo)法研究土壤微生物量的結(jié)果表明土壤中真菌和細(xì)菌的生物量相當(dāng)[36]。然而在真菌和細(xì)菌各自的微生物群落中，反硝化微生物的相對含量卻不一樣。本研究中通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，反硝化細(xì)菌拷貝數(shù)只占到細(xì)菌總數(shù)的1.48%～2.05%（表2），而高通量測序也表明反硝化細(xì)菌在細(xì)菌群落中的相對豐度是2.3%～3.3%（表3）。在真菌群落中，反硝化真菌的相對豐度是6.6%～53.8%（表4）；也有研究結(jié)果表明產(chǎn)N2O的真菌達到可培養(yǎng)真菌的33%～45%[37-38]。這些結(jié)果表明環(huán)境中反硝化真菌的生物量可能高于反硝化細(xì)菌，在酸性土壤中尤其如此，因為真菌有著更強的耐酸能力[25]，例如本研究中的設(shè)施菜地土壤。另外在設(shè)施菜地中，往往由于連作障礙會導(dǎo)致有害真菌的增加[39]；本研究中，菜地土壤中畫線殼屬（Monographella）和鐮刀屬（Fusarium）的相對豐度顯著高于稻田土壤，這兩種真菌也是常見的植物致病菌（表4）。

微生物的純培養(yǎng)實驗表明反硝化細(xì)菌產(chǎn)N2O能力約是反硝化真菌的10～100 000倍，而土壤培養(yǎng)實驗表明，反硝化真菌對N2O貢獻率與反硝化細(xì)菌相當(dāng)甚至超過了后者[29]。對于這一矛盾的結(jié)果，Mothapo等認(rèn)為雖然土壤培養(yǎng)實驗中使用的抑制劑法可能會高估真菌的貢獻率，但土壤真菌反硝化還是不能忽視的，因為純培養(yǎng)實驗的條件不能真實反映土壤的環(huán)境，而且可供培養(yǎng)的微生物只占到總微生物量很少的一部分[29]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了土壤中反硝化真菌的廣泛存在，其生物量在某些條件下可能大于反硝化細(xì)菌；另外，環(huán)境中不同的有機碳源可能高效地促進反硝化真菌的活動。鑒于此，未來的研究中我們還需要完善一些新的N2O溯源方法[40]，用來研究土壤中反硝化真菌對土壤N2O的貢獻及其影響因素。

4 結(jié)論

（1）有機小分子物質(zhì)的微量添加（≤1μmol C·g-1）可以顯著刺激土壤N2O排放，不同種類的有機碳刺激結(jié)果也不一樣；與葡萄糖相比，甲酸鹽對N2O的刺激作用是葡萄糖的1.7～3.38倍。

（2）菜地土壤的反硝化細(xì)菌數(shù)量只有稻田土壤的12%～15%，但在甲酸鹽的刺激下，菜地土壤最大的N2O的排放速率可以達到稻田土壤的1.6倍。菜地土壤中存在的大量反硝化真菌，其高效耦合甲酸鹽氧化和NO-

3還原過程很可能是菜地土壤排放大量N2O的主要原因。