底雪梅，袁曜暉，張 超，高 越

(1. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院，上海 201204；2. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 2503553;3. 海軍軍醫(yī)大學藥學院實驗教學中心，上海 200433)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性進展性肺纖維化疾病。該病預后差，中位生存期3～5年[1]。其治療手段有限，有待于有效藥物的開發(fā)研制。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪為君藥的中藥復方對IPF患者有較好的臨床療效[2-3]。黃芪甲苷(AS-Ⅳ)為黃芪中的主要活性成分，最近研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能通過抑制堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的表達，干預大鼠肺間質纖維化進程[4]。另有實驗表明，黃芪甲苷抑制IPF大鼠肺纖維化與其抑制肺組織CD34的表達有關[5]。以上研究表明，黃芪甲苷確有抗肺纖維化作用，但其具體機制尚未被闡明，靶分子尚不明確。

近年來，一些與特發(fā)性肺纖維化有關的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，如趨化因子CCL18。研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中CCL18含量明顯高于健康人群[6-7]，血清和BALF中的CCL18水平與肺功能呈負相關，如一氧化碳彌散量[8]。CCL18主要由呈遞抗原細胞，如單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞分泌[9-10]。在肺纖維化形成過程中，肺泡巨噬細胞被認為是CCL18的主要來源，且在肺纖維化病理中扮演重要角色[11]。關于黃芪甲苷對肺泡巨噬細胞及其CCL18分泌的作用尚未見報道，故本研究擬通過考察黃芪甲苷對CCL18表達的影響來探討其抗IPF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液、疊氮碘化丙錠(PMA)、重組人白細胞介素4(rhIL-4，GIBCO公司)；胎牛血清(Biowest公司)；吡非尼酮(Shionogi公司)；STAT6抑制劑(AS1517499，Axon公司)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies公司)；ISOGEN (Nippon Gene公司)；THUNDERBIRD Probe qPCR Mix試劑 (TOYOBO公司)；CCL18和β-actin探針(Life Technologies公司)；Cell-Based Elisa Kit試劑盒 (R&D Systems公司)；Z″-LYTETM激酶檢測試劑盒 (Life Technologies公司)；各種抗體(BioLegend公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分化

采用人單核細胞U937細胞株進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液：RPMI1640(含10%小牛血清，100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)；細胞濃度：1×106個/ml；培養(yǎng)環(huán)境：37℃，5%CO2，95%飽和濕度。巨噬細胞分化：用10 nmol/L PMA處理U937細胞株48 h，得到U937巨噬細胞。

1.3 細胞活力檢測

采用CCK-8法檢測細胞活力。主要步驟如下：調整U937巨噬細胞濃度為5×103個/ml(含)，種于96孔板，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～800 μg/ml)，孵育72 h，每孔加入10 μg/ml CCK-8溶液，37℃，5%CO2孵育1 h，在450 nm處用酶標儀測吸光度。

細胞活力=加藥組吸光度(A)值/對照組(A)值×100%。

1.4 Real-time PCR檢測基因表達

調整U937巨噬細胞濃度為1×106個/ml，種于6孔板，分別加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～200 μg/ml)或20 nmol/L AS1517499，共孵育48 h，收集細胞，按照ISOGEN總RNA提取試劑盒描述的方法提取裂解細胞的總RNA。用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒進行逆轉錄，用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix試劑盒和7500 FastReal Time PCR System檢測CCL18 mRNA表達，所有操作嚴格按說明書程序進行。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成，引物序列見表1。以β-actin基因表達作為內參照物，反應條件：95℃,50 s；再95℃,10 s，60℃,30 s，共40個循環(huán)。用比較CT值法計算相對表達水平。

表1 Real-time PCR引物序列

1.5 Elisa法測CCL18水平

調整U937巨噬細胞濃度為1×106個/ml，種于6孔板，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～200 μg/ml)或20 nmol/L AS1517499，共孵育48 h，收集細胞，用RIPA緩沖液裂解。用Human CCL18/PARC Quantikine Elisa Kit試劑盒測定CCL18含量，操作嚴格按說明書程序進行。

1.6 STAT6磷酸化檢測

用Cell-Based Elisa Kit試劑盒檢測STAT6磷酸化。主要操作為：調整U937巨噬細胞濃度為1×104個/ml，種于96孔板，37℃，5%CO2，孵育過夜，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)，藥物組加入黃芪甲苷(終濃度200 μg/ml)，對照組用培養(yǎng)液補齊，分別孵育0、20、40、60 min。陽性對照組加入20 nmol/L AS1517499，孵育40 min。對所有細胞固定和通透，再依次與一抗(兔抗phospho-STAT6抗體和鼠抗total STAT6抗體)及二抗(HRP標記的抗兔IgG和AP標記的抗鼠IgG)共孵育。最后，分別加入HRP和AP的熒光探針底物，酶標儀檢測熒光強度。

1.7 Z″-LYTETM激酶檢測

Z″-LYTETM法是一種非細胞離體檢測，是基于熒光共軛能量轉移來檢測多肽底物磷酸化程度，從而檢測蛋白激酶的方法。本試驗用Z″-LYTETM檢測黃芪甲苷對Janus激酶(JAK)家族JAK1、JAK2、JAK3、TYK2的抑制活性，對每種激酶的抑制率按照操作說明以百分比表示。

1.8 參與CCL18表達的STAT6檢測

IL-4與IL-4R結合可導致STAT6磷酸化而激活，為檢測STAT6磷酸化是否參與CCL18，采用STAT6選擇性抑制劑AS1517499，檢測其對U937巨噬細胞CCL18表達的影響。

1.9 流式細胞儀檢測IL-4R

調整U937巨噬細胞濃度為1×106個/ml，種于6孔板，加入rhIL-4 0.2 ng/ml，除對照組外，加入黃芪甲苷(終濃度200 μg/ml)，孵育48 h。收集細胞，再加入Human BD Fc Block以阻斷抗體與Fc受體的非特異性組合。然后分別加入PE和APC標記的抗體共孵育，使抗體分別與表面IL-4受體亞基IL-4Rα,common γ chain和IL-13Rα1相結合，所加抗體分別為：PE-抗-CD124 (IL-4Rα)、APC-抗-CD132 (common γ chain)、PE-抗-CD213 (IL-13Rα1)以及同型對照抗體。用流式細胞儀檢測各亞基表達，F(xiàn)lowjo軟件分析檢測結果。

1.10 統(tǒng)計學分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件完成，多組比較用one-way ANOVA分析，組間兩兩比較用Dunnett′s法或Tukey′s HSD法，以P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對細胞活力的影響

本研究采用CCK-8法考察黃芪甲苷的細胞毒作用。與對照組相比，400和800 μg/ml濃度的黃芪甲苷可以顯著抑制U937巨噬細胞的細胞活力，細胞相對活力分別為60.8%(P<0.01)和25.7%(P<0.01)，而0～200 μg/ml濃度組間比較，無顯著性差異(圖1)。因此，后續(xù)試驗采用200 μg/ml及以下濃度進行。

圖1 黃芪甲苷對U937巨噬細胞活力的影響 **P<0.01，與對照組即黃芪甲苷0 μg/ml濃度組比較

2.2 黃芪甲苷對U937巨噬細胞CCL18 mRNA和蛋白表達的影響

U937巨噬細胞本身表達低水平的CCL18，而Th2細胞因子如IL-4可刺激巨噬細胞M2型極化，從而上調CCL18的表達。故本試驗采用M2極化型U937巨噬細胞考察黃芪甲苷對CCL18表達的影響。試驗結果表明，rhIL-4刺激后，CCL18 mRNA和蛋白表達均上調，而黃芪甲苷能顯著抑制其上調，且呈明顯的量效依賴性(圖2)。

圖2 黃芪甲苷不同濃度對U937巨噬細胞CCL18 mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響 *P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與IL-4組比較

2.3 黃芪甲苷對IL-4R表達的影響

上述試驗結果提示黃芪甲苷可能通過影響IL-4R或其下游途徑因子的表達而抑制U937巨噬細胞CCL18表達。因此，本試驗采用流式細胞儀考察黃芪甲苷對U937巨噬細胞表面IL-4Rα,common γ chain和IL-13Rα1表達的影響。結果顯示黃芪甲苷對這些IL-4R組成亞基表達影響不顯著(圖3)。

2.4 STAT6對CCL18表達的影響

IL-4與IL-4R相結合可導致磷酸化STAT6而使其激活，因此本試驗考察STAT6激活是否參與CCL18表達，采用STAT6的選擇性抑制劑AS1517499來考察其對U937巨噬細胞CCL18表達的影響。結果顯示，AS1517499可顯著抑制CCL18 mRNA和蛋白表達，表明IL-4通過STAT6激活途徑來促進U937巨噬細胞CCL18表達(圖4)。因此，課題組又考察了黃芪甲苷對STAT6磷酸化的影響，結果顯示，IL-4刺激可顯著促進STAT6磷酸化，而用黃芪甲苷處理40 min可抑制該誘導作用，但AS1517499的抑制作用比黃芪甲苷更強(圖5)。

圖3 黃芪甲苷對IL-4R各亞基IL-4Rα、common γ chain、IL-13Rα1表達的影響 A.IL-4Rα;B.common γ chain;C.IL-13Rα1

圖4 AS1517499對CCL18 mRNA(A)和蛋白(B)表達的影響 *P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與IL-4組比較

圖5 黃芪甲苷對STAT6磷酸化的影響 *P<0.05，與40 minIL-4組比較；#P<0.05，分別與對照組、黃芪甲苷組、IL-4組、AS1517499組比較注：“—”表示未加入黃芪甲苷，“+”表示加入黃芪甲苷

2.5 黃芪甲苷對JAK激酶作用的影響

JAK家族如JAK1、JAK2、JAK3及TYK2在IL-4與IL-4R結合后參與STAT6磷酸化過程。Z″-LYTETM激酶檢測試驗結果表明，黃芪甲苷可顯著抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性，且呈明顯的量效依賴關系，而黃芪甲苷對JAK2激酶影響不明顯(圖6)，提示黃芪甲苷是通過抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性來抑制STAT6磷酸化。

3 討論

既往研究表明，IPF患者肺泡巨噬細胞選擇性激活，生物標志物CD206和CCL18的表達上調[11]。巨噬細胞的選擇性激活，主要由Th2細胞因子，如IL-4、IL-13誘導[12]。而IPF患者肺組織的細胞因子環(huán)境為Th2細胞因子主導[13-14]，因此，Th2細胞因子可能涉及IPF的病理過程。CCL18對T細胞、B細胞和未成熟的樹突狀細胞具有趨化活性以及促纖維化活性[15]。離體試驗表明，CCL18可刺激肺成纖維細胞的膠原生成[16]。在體試驗表明，大鼠肺組織CCL18的過表達導致T細胞浸潤和膠原沉著[17]。臨床試驗表明，血清CCL18的表達與患者肺功能和生存率呈相關性[6]。因此，CCL18被認為是肺纖維化的重要因子。

圖6 黃芪甲苷對JAK激酶活性的影響 A.對JAK1的抑制率；B.對JAK2的抑制率；C.對JAK3的抑制率；D.對TYK2的抑制率*P<0.05，與對照組即黃芪甲苷0 μg/ml濃度組比較

課題組采用IL-4刺激U937巨噬細胞發(fā)生M2型極化，來考察黃芪甲苷對其CCL18表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能顯著抑制CCL18 mRNA和蛋白的表達水平，且呈明顯的量效依賴性。為進一步考察其作用機制，考察了其對IL-4信號轉導的影響。首先，考察黃芪甲苷是否導致細胞IL-4受體IL-4R表達下調。IL-4R分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體，Ⅰ型IL-4受體由IL-4Rα鏈與γc(common α)鏈組成，而Ⅱ型IL-4受體由IL-4Rα鏈與IL-13Rα1鏈組成[18]。流式細胞儀分析顯示，黃芪甲苷對IL-4受體亞基IL-4Rα(CD124),common γ chain (CD132)和IL-13Rα1(CD213)的表達無顯著影響，提示黃芪甲苷不會引起IL-4受體下調。

隨后，課題組考察黃芪甲苷對與CCL18表達相關的IL-4受體下游信號因子STAT6的影響。首先，考察STAT6磷酸化抑制劑AS1517499對CCL18表達的影響，結果表明AS1517499顯著抑制CCL18 mRNA及蛋白表達，其抑制水平達到未受IL-4刺激的狀態(tài)，證明IL-4引起的CCL18表達是通過STAT6介導，磷酸化后的STAT6形成二聚體轉移至細胞核而引起轉錄。STAT6磷酸化試驗結果表明黃芪甲苷能抑制STAT6磷酸化，盡管抑制作用較AS1517499輕。因此，推測黃芪甲苷對CCL18表達的抑制作用在一定程度上是通過抑制STAT6磷酸化完成的。隨之進一步探討了黃芪甲苷抑制STAT6磷酸化的作用機制。IL-4 與其受體IL-4R結合激活STAT6磷酸化是通過JAK激酶完成。Z″-LYTETM激酶檢測結果表明，黃芪甲苷能顯著抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性，且呈量效依賴關系。

總之，黃芪甲苷可抑制IL-4引起的U937巨噬細胞CCL18的表達。其作用機制可能是通過抑制JAK激酶活性，引起STAT6的轉錄活性下調，從而抑制CCL18基因表達。然而，由于黃芪甲苷對STAT6磷酸化的抑制作用有限，因此推測只是其抑制CCL18表達的途徑之一，是否還通過其他途徑尚需要進一步的探討。