帥敏敏，張啟香，黃有軍

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

CONSTANS（CO）基因是植物響應(yīng)光周期調(diào)控的重要基因，位于生物鐘的輸出途徑上，能正調(diào)控下游開花基因SOC1和FT，進(jìn)而調(diào)控植物開花。PUTTERILL等［1］首先在擬南芥Arabidopsis thaliana中分離出CO基因，反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)到CO基因在根和葉中表達(dá)。ONOUCHI等［2］對(duì)花椰菜Brassica oler-acea 花葉病毒 35S（Cauliflower mosaic virus 35S,CaMV 35S）融合 CO（35S：CO）轉(zhuǎn)化擬南芥研究發(fā)現(xiàn)， CO蛋白會(huì)誘導(dǎo)早花和喪失光周期敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)［3］，CO在染色體上的位置介于生物節(jié)律鐘基因和下游開花基因之間，可將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_花信號(hào)。對(duì)擬南芥CO基因過表達(dá)研究［1］發(fā)現(xiàn)，CO基因過表達(dá)的植株比野生型提前開花，表明CO蛋白的活性決定開花時(shí)間；但這種調(diào)控在不同成員間并不一致，過表達(dá)COL1和COL2對(duì)植株開花時(shí)間沒有影響［4］，過表達(dá)COL9則導(dǎo)致開花延遲，但COL9缺失突變體在長日照下又表現(xiàn)為早花，說明COL9不但抑制CO基因表達(dá)調(diào)控開花時(shí)間，同時(shí)下調(diào)FT的表達(dá)水平從而延遲成花轉(zhuǎn)變［5］。COL3在擬南芥光形態(tài)建成時(shí)起正調(diào)控作用，促進(jìn)側(cè)根生長和花色素苷積累，并調(diào)節(jié)長日照敏感植物的花芽分化［6］。從形態(tài)來看，CO基因常以多拷貝的形式存在，如擬南芥的CO家族有17個(gè)成員［7］，水稻Oryza sativa中有16個(gè)成員［8］，甘藍(lán)型油菜Brassica napus中也克隆到4個(gè)CO同源基因［9］。但各CO家族成員的功能存在明顯差異。葡萄Vitis vinifera的VvCOL1主要在芽休眠過程中起作用，表明該基因參與光周期，控制芽休眠的誘導(dǎo)和維持［10］。擬南芥中過表達(dá)衣藻Chlamydomonas reinhardtii的CrCO會(huì)表現(xiàn)出早花表型，結(jié)合衣藻的研究發(fā)現(xiàn)：CrCO對(duì)淀粉的合成和細(xì)胞分裂有調(diào)節(jié)功能，推測(cè)CO在高等植物中可能仍保持調(diào)節(jié)淀粉合成［11］。大麥Hordeum vulgare的HvCO1和Hd1基因與CO親緣關(guān)系最近，可以通過激活HvFT1誘導(dǎo)大麥開花［8］，但在轉(zhuǎn)基因擬南芥中則丟失該功能［12］。擬南芥co突變體過表達(dá)牽?；↖pomoea nil的PnCO基因可促進(jìn)植物開花［13］。黑麥草Lolium perenne的LpCO可以互補(bǔ)擬南芥co突變體的晚花表型［14］，甜菜Beta vulgaris的BvCO1可以修復(fù)擬南芥co-2突變體的晚花表型［15］。大豆Glycine max的GmCO9影響根的發(fā)育，與種子的成熟密切相關(guān)［16］。毛果楊Populus trichocarpa的PtCO促使植株提前開花，也可調(diào)控植株的生長和芽的分化［17］。本研究以14個(gè)已被測(cè)序的物種為試驗(yàn)材料，通過生物信息學(xué)手段，從外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、基因重復(fù)、基因差異表達(dá)分析等3個(gè)方面開展CO家族研究，為探討不同家族成員的潛在功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的收集及本地?cái)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建

從植物基因組數(shù)據(jù)Phytozome（http：//www.phytozome.net）中下載其中13個(gè)物種的全基因組序列、蛋白質(zhì)及對(duì)應(yīng)編碼序列（coding sequence,CDS），分別為藻類植物1種，苔蘚植物1種，蕨類植物1種，被子植物9種（長日照植物、短日照植物和日中性植物各3種），以無油樟Amborella trichopoda作為被子植物的對(duì)照。此外裸子植物1種（挪威云杉Picea abies），其相應(yīng)序列來源于http：//congenie.org。

數(shù)據(jù)查找步驟：①從PFAM蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得CO結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型（PF06203和PF00643）并作為查詢序列，得到的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存于Windows平臺(tái)環(huán)境下構(gòu)建的各個(gè)物種全基因組氨基酸序列的本地?cái)?shù)據(jù)庫中。②利用HMMER軟件包的hmmsearch程序，默認(rèn)參數(shù)條件下在本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTP搜索，篩選出符合E-value≤0.01的蛋白質(zhì)序列作為CO候選同源蛋白。③將備選CO基因的CDS序列通過BLASTN的比對(duì)，在全基因組核酸序列中搜索，獲得CO在染色體上準(zhǔn)確定位信息。④在PFAM蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和SMART蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下對(duì)搜索得到的所有同源候選基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行鑒定，剔除不含CO（PF06203和PF00643）結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。以此完成各個(gè)物種CO家族所有成員的鑒定。

1.2 多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MUSCLE的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)分析；使用MEGA 7.0對(duì)完成比對(duì)的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；構(gòu)建方法選用鄰近法（NJ）；距離模型采用泊松矯正；空位缺失數(shù)據(jù)的處理采用兩兩刪除；系統(tǒng)發(fā)育統(tǒng)計(jì)的可靠性檢測(cè)采用bootstrap分析，使用1 000次重復(fù)。

1.3 外顯子-內(nèi)含子分析

利用在線軟件GSDS（Gene Structure Display Server）比較CO家族成員的CDS序列和基因序列，分析CO家族基因的外顯子-內(nèi)含子組成和分布，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，探究CO在基因結(jié)構(gòu)上的進(jìn)化規(guī)律。

1.4 共線性分析

利用植物基因組PGDD數(shù)據(jù)庫（http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/）搜索染色體上的共線性片段，分析含有的CO基因的共線性區(qū)段，研究CO家族不同成員的相互聯(lián)系和進(jìn)化過程。

1.5 水稻CO家族基因的表達(dá)分析

搜索14個(gè)物種的國際核酸序列數(shù)據(jù)庫（NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），發(fā)現(xiàn)水稻關(guān)于繁殖發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)最為完整。利用GEO數(shù)據(jù)庫（GSE56463）下載水稻8個(gè)不同時(shí)期不同部位（花芽、花、開花前的旗葉、開花后的旗葉、開花前的根、開花后的根、未成熟種子、成熟種子）的植物組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（RNA-seq）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)全部采用FPKM標(biāo)準(zhǔn)化后的值。以水稻為例，從轉(zhuǎn)錄水平重點(diǎn)分析CO家族不同成員在花發(fā)育和種子形成過程中的表達(dá)變化，從而探討它們可能的生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO家族成員的鑒定

搜索14個(gè)物種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的CO家族成員，共鑒定出159個(gè)含有CO結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列。結(jié)果表明：CO常以多拷貝的形式存在于植物中，與以往的研究一致［8］?？截悢?shù)最多的物種是大豆，鑒定出25個(gè)家族成員。其次在胡蘿卜Daucus carota，小立碗蘚Physcomitrella patens，菜豆Phaseolus vulgaris，番茄Solanum lycopersicum，黃瓜Cucumis sativus和蓖麻Ricinus communis中，分別鑒定到18，15，13，13，12和10個(gè)拷貝。在小麥，無油樟和卷柏Selaginella moellendorffii中，也發(fā)現(xiàn)了5，5和4個(gè)CO基因家族成員。挪威云杉和衣藻中拷貝數(shù)最少，各存在3個(gè)成員。

2.2 CO家族進(jìn)化分析

使用鄰近法對(duì)得到的14個(gè)物種159個(gè)CO蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由生成的無根系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）可知，植物CO家族在進(jìn)化中具有多樣性，大部分同一譜系的物種基因都能聚類在同一進(jìn)化枝上。根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征，選取支持度高且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的3個(gè)亞家族（分別命名為B1，B2和B3）作為后續(xù)研究CO基因的基礎(chǔ)框架。其中B1亞家族含2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域；B2亞家族含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域，1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；B3亞家族含1個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。

圖1 CO家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of CO family members

2.3 內(nèi)含子和外顯子的分布

CO家族成員的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)（圖2）顯示，多數(shù)物種的CO基因中存在2～4個(gè)外顯子，同一亞家族內(nèi)基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和長度高度相似，說明這些物種的CO基因家族成員之間的親緣關(guān)系也較近，同時(shí)也證實(shí)了CO基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的可信度。具體而言，B1亞家族中的大多數(shù)基因含2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子；B2亞家族中則表現(xiàn)為每個(gè)CO基因含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，且排列相位表現(xiàn)出“0，0，2”規(guī)律；B3亞家族相對(duì)較為復(fù)雜，多數(shù)的CO基因含有2個(gè)外顯子，部分含有4個(gè)外顯子，但也有例外，如CrCO3基因，不僅長度較大，還發(fā)現(xiàn)存在14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，體現(xiàn)在系統(tǒng)進(jìn)化樹中則出現(xiàn)CrCO3分化為獨(dú)立的進(jìn)化枝。研究還發(fā)現(xiàn)，CO基因包含大量的相位為0的內(nèi)含子，表明外顯子改組可能在CO基因的進(jìn)化中起著一定的作用，而外顯子的插入和內(nèi)含子的刪除可以認(rèn)為是形成多元化的CO基因以及功能差異的CO蛋白的原因之一。

2.4 CO家族成員共線性分析

對(duì)擬南芥、菜豆、蓖麻3種植物CO家族的基因復(fù)制事件的研究可以用來檢測(cè)CO基因家族中遺傳差異間的聯(lián)系和相應(yīng)的擴(kuò)張模式，CO家族的成員可作為錨定基因研究所在染色體區(qū)段的分子進(jìn)化歷史。染色體定位分析（圖3，圖4）表明，絕大多數(shù)的CO基因在基因組中是隨機(jī)分布的，僅在少數(shù)位點(diǎn)形成串聯(lián)的基因簇，因此大規(guī)模的基因復(fù)制事件可能在CO基因家族的進(jìn)化過程中扮演著重要的角色。共線性分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥、菜豆和蓖麻的染色體區(qū)域間存在強(qiáng)烈且保守的共線性。由圖3和圖4可知：擬南芥CO家族所在的共線性區(qū)域最多有22對(duì)基因；菜豆和蓖麻內(nèi)部也存在廣泛的共線性情況，例如Pv-CO5-PvCO7，RcCO5-RcCO10；此外，擬南芥與菜豆和蓖麻之間的共線性情況也非常普遍，例如At-COL3-RcCO1，AtCOL3-PvCO1，PvCO7-RcCO4。根據(jù)這些基因的共線性分析結(jié)果可推測(cè)，CO家族中重復(fù)基因的擴(kuò)張與基因組重復(fù)有著密切的聯(lián)系。

圖2 B1，B2和B3亞家族CO基因外顯子和內(nèi)含子分布Figure 2 Exon-intron structures of CO genes in B1,B2 and B3 subfamily

2.5 水稻CO家族基因的表達(dá)和功能分化

圖3 物種內(nèi)CO家族成員的共線性分析Figure 3 Synteny analysis of CO family genes in species

圖4 物種之間CO家族基因共線性分析Figure 4 Synteny analysis of CO family genes among species

基因表達(dá)的差異性反映了基因的功能分化。水稻轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜顯示（圖 5），CO基因在花芽、花、根、旗葉和種子中都有表達(dá)，以O(shè)sCO3，OsCO6，OsCO7，OsCO8，OsCO9，OsCO11，OsCO12和Os-CO16這8個(gè)基因的表達(dá)量較高，尤其是在開花后的根和開花前后的旗葉中的表達(dá)量更為明顯。具體來看，OsCO3和OsCO6基因在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程、開花前后的根和旗葉中的表達(dá)量升高，在根中的表達(dá)量升高，在乳粒（未成熟的種子）到成熟種子的過程中表達(dá)量下降，說明OsCO3和OsCO6基因負(fù)向調(diào)控花芽到花的轉(zhuǎn)變過程。OsCO8在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程、開花前后的根、開花前后的旗葉和乳粒到成熟種子的過程中表達(dá)量都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明OsCO8對(duì)花的發(fā)育以及果實(shí)成熟有重要的調(diào)控作用。OsCO12在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程、開花前后的根和乳粒到成熟種子的過程中表達(dá)量上升，在開花前后的旗葉中的表達(dá)量下降，說明OsCO12對(duì)水稻花的發(fā)育起著最為關(guān)鍵的調(diào)控作用。OsCO7，OsCO9和OsCO11基因在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程、開花前后的旗葉和乳粒到成熟種子的過程中表達(dá)量下降，在開花前后的根中的表達(dá)量明顯上升，說明OsCO7，OsCO9和OsCO11基因可以正向調(diào)控花芽到花的轉(zhuǎn)變過程。OsCO16在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)量下降，在開花前后的根和旗葉、乳粒到成熟種子的過程中表達(dá)量上升，說明OsCO16對(duì)花的發(fā)育和果實(shí)成熟有重要的調(diào)控作用。水稻中不同CO基因在不同時(shí)期不同組織器官中的表達(dá)量不同，表明同一家族不同基因之間存在功能上的差異。

圖5 水稻CO基因的表達(dá)譜Figure 5 Expression profile of CO gene in rice

3 討論

CO基因是植物光周期途徑中調(diào)控開花時(shí)間的重要基因。光周期途徑中，PHYA，CRY1和CRY2基因相互作用，影響GI等生物節(jié)律鐘基因，促進(jìn)CO基因的表達(dá)；CO編碼轉(zhuǎn)錄因子作用于FT［18］，使FT從維管束組織轉(zhuǎn)移到莖頂端分生組織，致使花器官發(fā)育［19］。通過對(duì)14個(gè)物種的CO基因的分析，本研究發(fā)現(xiàn)：CO基因常以多拷貝的形式存在于植物中，與已有研究結(jié)果一致［20］；親緣關(guān)系較近的物種，其CO基因的相似性較高；CO基因在裸子植物和被子植物、雙子葉植物與單子葉植物、不同科和不同屬植物之間都存在明顯分化，表明CO基因在植物進(jìn)化中既相對(duì)保守又不斷進(jìn)化，其進(jìn)化過程與整個(gè)物種進(jìn)化過程相對(duì)同步，說明CO基因可能對(duì)植物進(jìn)化起到了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)巫尤~植物發(fā)生過2次基因組重復(fù)［21］，一半的水稻基因組基因來源于基因組重復(fù)［22］。對(duì)水稻的基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：CO基因在花、葉、根和莖中都有表達(dá)，OsCO3的表達(dá)量在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程中上升，推測(cè)OsCO3負(fù)調(diào)控花芽到花的轉(zhuǎn)變過程，與KIM等［23］發(fā)現(xiàn)的OsCO3通過負(fù)調(diào)控Hd3a和FT-like（FTL）的表達(dá)延遲短日照下水稻開花的結(jié)果一致；OsCO7基因在花芽到花的轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)量下降，說明OsCO7正調(diào)控Hd3a的表達(dá)，促進(jìn)短日照下水稻的開花，與XUE等［24］研究結(jié)果一致。在短日照條件下，水稻的Hd1抑制Hd3a的轉(zhuǎn)錄從而控制開花轉(zhuǎn)型［25］，這一結(jié)果和擬南芥CO基因在短日照條件下促進(jìn)FT的表達(dá)控制開花轉(zhuǎn)型相反，說明CO基因?qū)τ诨ㄑ康交ǖ陌l(fā)育起到重要調(diào)控作用，進(jìn)一步證實(shí)了水稻不同CO基因在功能上存在差異。本研究結(jié)果有助于更加深入地了解CO基因家族成員的潛在功能，為CO基因在光周期途徑中調(diào)控成花發(fā)育過程提供理論依據(jù)。