劉 華，薛金嫚，徐倩玉，易 昕，王維艷，劉宏波

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

花生Arachis hypogaea是世界上最主要的油料作物之一，種子含油量為46%～60%，較其他油料作物含油量高［1］。 在花生油的脂肪酸組成中， 油酸（oleic acid， C18∶1）和亞油酸（linoleic acid， C18∶2）約占總脂肪酸的80%；且油酸的自氧化穩(wěn)定性是亞油酸的10倍，所以高油酸的花生具有較長的儲存期。 因此，油酸和亞油酸的比值（O/L）是評定花生油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一［2-3］。油酸可調(diào)整人體血漿中高、低密度脂蛋白膽固醇的比例，對軟化血管，保護人體健康有一定效用［4］；另外，在糧油業(yè)中，以高O/L花生為原料可避免在加工過程中過度氫化，產(chǎn)生反式脂肪酸危害人體健康［5］。所以，研究調(diào)控O/L的分子機制，適當(dāng)提高O/L具有重要意義。近年來，利用基因工程手段提高花生中油酸的研究日益增多，對控制O/L的重要基因的研究也逐漸深入［6］?；ㄉ写呋退徂D(zhuǎn)變?yōu)閬営退岬拿甘且环N存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ω-6去飽和酶FAD2［7］，且酶的活性與其基因表達水平呈正相關(guān)［8］；轉(zhuǎn)錄水平的表達分析顯示，F(xiàn)AD2在高油酸花生品種中的表達量明顯低于普通油酸花生中的表達量［9］，且FAD2在O/L范圍為1.07～6.80的花生中，均在花中表達量最高，莢果次之，根、莖、葉中表達量較低［10-11］。FAD2活性受2個序列相似性為 99%的基因 AhFAD2A（Ol1Ol1）與 AhFAD2B（Ol2Ol2）調(diào)控［12］。 在 AhFAD2A 編碼區(qū)的核苷酸序列中， 若在距起始密碼子448 bp處發(fā)生單堿基替換（G∶C/A∶T），則會造成氨基酸序列出現(xiàn)錯義突變，使天冬氨酸改變?yōu)樘於０罚欢贏hFAD2B中，在442 bp處插入A（A∶T）則會發(fā)生移碼突變，使終止密碼子提前［13］。這2類突變可降低或消除油酸脫氫酶FAD2的活性［14］。在酵母異源表達體系中研究發(fā)現(xiàn)，AhFAD2B脫氫酶活性要比AhFAD2A高，前者催化生成亞油酸的量約是后者催化生成亞油酸量的10倍［15］，但Ah-FAD2A與AhFAD2B在不同O/L值花生中單獨的表達情況，以及AhFAD2B是否為調(diào)控花生O/L的主要基因，目前還不明確。為了進一步了解花生調(diào)控O/L的分子機制及遺傳基礎(chǔ)，一些研究者針對FAD2突變體花生品種的選育開發(fā)了位點特異性基因標(biāo)記AS-PCR（allele-specific polymerase chain reaction）［16］和酶切擴增多態(tài)序列標(biāo)記CAPS［17］等標(biāo)記方法，但這些方法僅可篩選特定類型的突變體，并不能簡單便捷地區(qū)分未發(fā)生突變的原始的AhFAD2A和AhFAD2B，且僅用一種方法不能有效區(qū)分四倍體花生突變基因型Ol1ol1/Ol2Ol2和 ol1ol1/Ol2Ol2或者Ol1Ol1/Ol2ol2和 Ol1Ol1/ol2ol2。目前，新采用的利用TaqMan探針熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）標(biāo)記鑒定基因型的方法［18］因價格高昂也無法普及。本研究根據(jù)Ah-FAD2A和AhFAD2B在3′-UTR核苷酸序列的差異設(shè)計了新型簡便的特異性區(qū)分兩者的引物，以高產(chǎn)、耐肥和抗倒伏花生新品種 ‘山花15’（O/L為1）和高油酸花生突變體（O/L大于20）為試驗材料，利用qRT-PCR技術(shù)，對2個花生品種不同組織中AhFAD2A和AhFAD2B各自的表達進行相對定量分析，以探究AhFAD2A和AhFAD2B基因各自的時空表達特點，為花生油酸脫氫酶基因AhFAD2A和AhFAD2B對O/L調(diào)控機制的深入研究以及日后高油酸含量花生品種的研制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以目前國內(nèi)主推的農(nóng)藝性狀優(yōu)良花生品種 ‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L為1，OL1OL1OL2OL2）以及高油酸花生突變體（O/L大于20,ol1ol1ol2ol2）為試驗材料，其中高油酸花生突變體的AhFAD2A編碼區(qū)核苷酸序列448 bp處發(fā)生單堿基替換（G∶C/A∶T，D/N）， 且 AhFAD2B編碼區(qū) 442 bp處插入 A（A∶T）發(fā)生移碼突變，使終止密碼子提前。RNA提取試劑盒 （杭州新景，貨號5111050）分離各組織部位 （根、莖、葉、花、開花后20 d種子、開花后40 d種子、開花后60 d種子）的總核糖核酸（RNA），第1鏈cDNA合成采用PrimeScript RT reagent Kit with cDNA Eraser試劑盒（TaKaRa,Cat.RR047A），定量PCR熒光染料為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa,Cat.RR470A）。

1.2 四倍體花生AhFAD2A和AhFAD2B基因的序列分析

以GenBank中異源四倍體花生FAD2基因（NCBI登錄號：DQ666829）與Peanut Base中二倍體花生（A.duranensis，A.ipaensis）基因組進行 BLAST檢索， 基于 5′-UTR和 3′-UTR設(shè)計通用引物 FAD2-F，F(xiàn)AD2-R，分別以 ‘山花15’ 和高油酸花生突變體基因組模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：10.0 μL 5×PrimerSTAR 緩沖液， 4.0 μL dNTP 混合物， 1.0 μL FAD2-F（10 μmol·L-1）， 1.0 μL FAD2-R（10 μmol·L-1），0.5 μL PrimerSTAR HS DNA 聚合酶（0.5×16.67 mkat·L-1）， 20 ng 模板，用雙蒸水（ddH2O）補齊至 50 μL；反應(yīng)條件為：1.98℃ 5 min，2.98℃ 15 s，3.58℃ 15 s，4.72℃ 2.5 min，第2～4步驟循環(huán)35次，5.72℃10 min。利用Vector-NTI軟件分析比對TA克隆序列。

1.3 四倍體花生AhFAD2A和AhFAD2B基因特異性引物的設(shè)計

依據(jù)3′-UTR核苷酸序列不同，設(shè)計區(qū)分AhFAD2A與AhFAD2B的特異性引物FAD2A-F，F(xiàn)AD2AR，F(xiàn)AD2B-F，F(xiàn)AD2B-R，并同內(nèi)參基因（β-Actin）［19］一起用于熒光定量PCR分析。以上引物均利用Vector-NTI設(shè)計并由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers designed for reference genes AhFAD2A and AhFAD2B

1.4 四倍體花生AhFAD2A和AhFAD2B基因組織特異性熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系：配置25.0 μL反應(yīng)混合液，包括12.5 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）（2×）， 1.0 μL 上游引物（10 μmol·L-1）， 1.0 μL 下游引物（10 μmol·L-1）， 2.0 μL RT 反應(yīng)液（cDNA溶液），8.5 μL滅菌水；使用Bio-Rad CFX Connect定量分析儀進行定量分析，每個反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)條件為：1.95℃ 2 min，2.95℃5 s，3.60℃30 s，第2～3步驟循環(huán)39次，4.95℃ 5 s，5.65℃ 5 s，6.95℃ 5 s。AhFAD2A與AhFAD2B基因表達量以內(nèi)參基因（β-Actin）作為標(biāo)準(zhǔn)，以AhFAD2A在‘山花15’莖中的表達量為1，運用2-△Ct△Ct法進行相對定量分析。

1.5 花生不同組織油酸和亞油酸相對含量的測定

花生種子脂肪酸含量的分析方法參考QUEHENBERGER等［20］和VONGSVIVUT等［21］并稍作修改?；ㄉ?莖和葉脂質(zhì)提取方法： ①液氮研磨樣本， 并加入提取液［V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（甲酸）=10∶10∶1］過夜萃??； ②離心并吸取上層提取液； ③用［V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=5∶5∶1］洗滌沉淀， 再次萃取， 并與之前提取液合并；④加入混合液（0.2 mol·L-1磷酸，1.0 mol·L-1氯化鉀），混勻離心，并吸取下層氯仿相；⑤用氮吹儀濃縮氯仿相即得到脂質(zhì)提取物。

運用Agilent 7890B GC氣相色譜儀進行樣品脂肪酸的分離，色譜條件參考文獻［22］。程序升溫：160℃保持1.5 min，然后以20℃·min-1升至240℃，保持5 min，總運行時間為10.5 min；進樣口溫度為260℃；空氣流量為300.0 mL·min-1，氫氣燃氣流量30.0 mL·min-1，尾吹氣（氮氣）流量25.0 mL·min-1，載氣（氦氣）流量1.533 4 m·min-1，分流比30，進樣量為1.0 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAD2A和AhFAD2B區(qū)分及特異性引物專一性檢測

將在GenBank中已登錄的異源四倍體花生FAD2編碼區(qū)基因片段（NCBI登錄號：DQ666829）與Peanut Base中2種二倍體花生（A.duranensis，A.ipaensis）基因組進行BLAST檢索，共發(fā)現(xiàn)3個Ah-FAD2基因，并可分為2種情況：一類是含1 140 bp的開放閱讀框（ORF），編碼379個氨基酸組成的完整蛋白（AhFAD2A和AhFAD2B），序列同源性為99%；另一類為1 147 bp的ORF，由于核苷酸序列中第451位堿基由G突變?yōu)門（G451T），形成TAA終止子且在674～680 bp有7 bp的插入導(dǎo)致移碼，使翻譯提前終止，不能編碼完整的蛋白而成為假基因（表2）。

表2 二倍體花生中AhFAD2基因序列差異性分析Table 2 Differences of AhFAD2 sequences in diploid peanuts

由于以上同源基因序列是在原始的二倍體花生中獲得，而本研究材料 ‘山花15’ 和高油酸花生突變體為人工選育的四倍體花生品種，所以需先用通用引物擴增 ‘山花15’ 和高油酸花生突變體基因組得到包含5′-UTR和3′-UTR的四倍體花生FAD2基因序列，然后再設(shè)計特異性引物區(qū)分同源基因Ah-FAD2A和AhFAD2B。所以在以上3個比對位點5′-UTR和3′-UTR設(shè)計通用引物FAD2-F，F(xiàn)AD2-R，以‘山花15’和高油酸花生突變體基因組為模板，用此引物擴增包含5′-UTR和3′-UTR的AhFAD2基因片段1 700 bp左右，將擴增得到的目的片段進行TA克隆，利用Vector-NTI軟件分析比對TA克隆的序列進行分析，也分為3類：AhFAD2A，AhFAD2B和假基因，與二倍體花生相同。依據(jù)AhFAD2A和Ah-FAD2B基因3′-UTR序列不同，設(shè)計了特異性熒光定量PCR引物FAD2A-F，F(xiàn)AD2A-R，F(xiàn)AD2B-F，F(xiàn)AD2B-R，并檢測了所設(shè)計引物的專一性。結(jié)果表明：AhFAD2A與AhFAD2B特異引物在擴增其對應(yīng)模板時，擴增循環(huán)閾值（Ct）最小，且在最佳范圍內(nèi)（15≤Ct≤20），表明引物專一性良好，適用于AhFAD2A和AhFAD2B序列的鑒別（圖1）。

圖1 AhFAD2A與AhFAD2B特異引物專一性檢測結(jié)果Figure 1 Primers specificity of AhFAD2A and AhFAD2B tested by qRT-PCR

2.2 AhFAD2A和AhFAD2B基因的表達模式

花生各組織總RNA的提取如圖2所示，28S和18S條帶清晰，其D（260）/D（280）均約1.85，表明所提取的RNA的完整性和純度均很好，可反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA進行熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù) ‘山花15’和高油酸花生突變體的7個不同組織中熒光定量PCR中的Ct值，計算AhFAD2A和AhFAD2B與內(nèi)參基因的表達量，以AhFAD2A在 ‘山花15’莖中的表達量為1，運用2－△Ct△Ct法進行相對定量分析（表3）。結(jié)果表明：AhFAD2A和AhFAD2B在 ‘山花15’和高油酸花生突變體中均有表達，兩者在花和開花后40 d的種子中表達量顯著高于在其他組織中的表達量；其中，在高油酸花生突變體3個不同發(fā)育時期種子中AhFAD2A和AhFAD2B表達量均顯著低于在 ‘山花15’種子中2個基因的表達量，表明AhFAD2A和AhFAD2B協(xié)同調(diào)控花生O/L；同時，‘山花15’種子中AhFAD2B的表達量顯著高于Ah-FAD2A，而在高油酸花生突變體種子中則相反，表明AhFAD2B在催化油酸去飽和生成亞油酸的過程中比AhFAD2A可能起更重要的調(diào)控作用。

‘山花15’和高油酸花生突變體AhFAD2A和AhFAD2B在花后20，40，60 d的種子中表達量呈“低—高—低”模式，推測在開花至花后40 d這一階段的種子中FAD2的表達量可能對花生最終O/L起主要的調(diào)控作用。

圖2 ‘山花15’和高油酸花生突變體不同組織樣本的總RNA電泳條帶分析Figure 2 Total RNA of different tissues in ‘Shanhua 15’ and high-oleate peanut mutants

表3 AhFAD2A與AhFAD2B在 ‘山花15’和高油酸突變體不同組織中表達量差異分析Table 3 Multiple comparison of AhFAD2A and AhFAD2B expression in ‘Shanhua15’ and high-oleate peanut mutants

2.3 ‘山花15’和高油酸花生突變體各組織的油酸和亞油酸相對含量

測定 ‘山花15’和高油酸花生突變體根、莖、葉及成熟種子中油酸和亞油酸相對含量，可知根、莖和葉中油酸和亞油酸相對含量在品種間無顯著差異，而在成熟種子中2個花生品種的油酸和亞油酸相對含量均差異顯著（圖3），表明FAD2對花生種子中的O/L有重要影響。

圖3 ‘山花15’和高油酸花生突變體根、莖、葉和成熟種子中油酸與亞油酸相對含量Figure 3 Oleic acid and linoleic acid content in roots,stems,leaves and pods of ‘Shanhua 15’ and high-oleate peanut mutants

3 討論與結(jié)論

依據(jù)AhFAD2A和AhFAD2B基因3′-UTR序列不同而設(shè)計的特異性熒光定量PCR引物（FAD2A-F，F(xiàn)AD2A-R，F(xiàn)AD2B-F及FAD2B-R），經(jīng)檢測專一性良好，可成為一種新型簡便的鑒定方法。同時，由于特異性引物區(qū)分位點在3′-UTR，因此，該引物在篩選特定類型的AhFAD2突變體方面也有著寬廣的應(yīng)用前景。例如，可與特定的AhFAD2開放閱讀框突變位點組合，設(shè)計與突變位點有關(guān)的特異上游引物，用于突變體基因型的鑒定。

AhFAD2A和AhFAD2B在 ‘山花15’和高油酸花生突變體7個組織中均有表達，但在根、莖和葉中表達量較低，在花和種子中表達量很高。2個不同O/L花生品種在根、莖和葉中油酸和亞油酸的相對含量并沒有差異，而在種子中差異顯著。這可能是由于在根、莖和葉中，質(zhì)體酰基載體蛋白去飽和酶發(fā)揮主要作用，而在種子中主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的酰基-脂質(zhì)去飽和酶起主導(dǎo)作用［23］，所以FAD2對種子中的脂肪酸含量有重要影響。AhFAD2B在 ‘山花15’各組織中表達量均顯著高于AhFAD2A；在高油酸花生突變體3個不同發(fā)育時期的種子中，AhFAD2B的表達量顯著低于AhFAD2A，但兩者的表達量均下降，且AhFAD2B表達量的下降幅度大。以往研究表明，AhFAD2B基因較AhFAD2A相對保守，且其活性對花生O/L影響更大［9］，在酵母異源表達體系中，AhFAD2B脫氫酶的活性要高于AhFAD2A［15］；本研究結(jié)果與這些研究結(jié)論相符，推測 ‘山花15’和高油酸花生突變體中AhFAD2B脫氫酶在催化油酸去飽和生成亞油酸的過程中比AhFAD2A可能起更重要的調(diào)控作用?；ê?0，40和60 d種子中FAD2相對表達量有顯著差異，在2個花生品種間基因表達量也差異顯著，AhFAD2A和AhFAD2B在開花后40 d的種子中表達量最高。陳四龍等［24］指出：花生油脂積累過程分為初始、快速和穩(wěn)定積累3個階段，主要在前2個階段有較集中的積累。遲曉元等［25］研究顯示：花生果針下地40 d前油脂累積速率顯著大于40 d之后，呈現(xiàn)先快后慢的累積模式。本研究中FAD2表達量的變化趨勢與種子發(fā)育過程中油脂的積累情況相符，推測在開花后至40 d這一階段FAD2在種子中的表達量可能對花生最終O/L起主要調(diào)控作用，若對這一發(fā)育時期進行基因手段干預(yù)，如改變這一時期FAD2的啟動子，可能使花生籽粒的油酸提高。

本研究所選用的 ‘山花15’為目前國內(nèi)主推的具有高產(chǎn)、耐肥和抗倒伏等農(nóng)藝性狀優(yōu)良的花生新品種，高油酸花生突變體也為具有目前世界范圍內(nèi)主流的高油酸性狀突變類型的突變體品種，且它們的O/L具有顯著差異，所以結(jié)果具有一定的代表性與應(yīng)用價值?；ㄉ舅峤M成和油脂累積是一個協(xié)同作用且復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前還未有對具有AhFAD2A和AhFAD2B單獨純合突變基因型的花生品種進行基因表達的研究，所以FAD2基因?qū)ㄉ鶲/L的影響還需要更深入的探索。