王勇勝，潘銀鳳，呂瑞峰，崔山龍，陳少宏

（1.山東省莘縣第二人民醫(yī)院，山東 莘縣 252423；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春130117；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

病毒性心肌炎常見于兒童及青壯年，其引發(fā)的心力衰竭（以下簡稱心衰）是發(fā)生不良事件的重要原因之一[1]。在心衰的過程中，失衡的心肌細胞能量代謝是其進展的關(guān)鍵因素。骨膜蛋白與鈣聯(lián)蛋白心室重構(gòu)、心衰后疾病轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[2-3]。目前，氧化苦參堿通過多條信號通路改善心衰患者的心功能，抑制心室重構(gòu)，已成為研究熱點[4-5]。本研究采用柯薩奇B3病毒（CVB3）感染BALB/c小鼠復(fù)制病毒性心肌炎心衰模型，觀察氧化苦參堿對心衰小鼠心肌能量代謝、心室重構(gòu)、細胞凋亡的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein,GRP78）、C/EBP 環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）、骨膜蛋白、鈣聯(lián)蛋白、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）一抗購自美國Abcam公司，游離脂肪酸（free fat acid, FFA）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）、腺苷酸（adenine nucleotides, AMP）、乳酸（lactic acid, LA）的ELISA試劑盒購自瑞士Roche公司，Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ, Col Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（collagen typeⅢ , Col Ⅲ ）、NP-proBNP試劑盒購自深圳欣博盛公司。Vivid E9多普勒彩色超聲（美國GE公司），JEM-2100型透射電鏡（日本JEOL公司），CVB3病毒株（吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗動物中心病毒室），病毒原液效價為1×10-3TCID50/L。

1.2 動物模型的復(fù)制及分組

50只雄性SPF級BALB/c新生小鼠由廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為對照組、模型組，以及低、中、高劑量組，每組10只。模型組與氧化苦參堿（低、中、高劑量）組均腹腔注射0.1 ml 1×10-9TCID50 CVB3病毒；低、中、高劑量組在模型組基礎(chǔ)上皮下注射氧化苦參堿13、26和52 mg/kg[6]。從注射病毒起每日記錄小鼠的日常及死亡情況。

1.3 心臟多普勒超聲檢查

給藥14 d后，使用GE Vivid E9彩色超聲顯像儀，對每組小鼠行經(jīng)胸心臟超聲心動圖檢查。經(jīng)胸壁高頻超聲ML6-15探頭，頻率13 MHz，圖像深度3.5 cm。采用10%水合氯醛（0.2 g/kg）腹腔注射麻醉小鼠，在二維超聲引導(dǎo)下，用M型超聲測定左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension,LVESd）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular enddiastolic dimension, LVEDd）、左室短軸縮短率（fractional shortening, FS）及左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF），測量4個連續(xù)完整心動周期，計算平均值[7]。實驗于廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部完成。

1.4 病理取材及切片

心臟超聲心動圖檢查后，采用腹主動脈放血方式處死小鼠，并在無菌狀態(tài)下用眼科剪進行病理取材。將心肌樣本投入到4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后，置于切片機中連續(xù)切片。經(jīng)脫蠟、二甲苯透明后進行HE染色，另取一部分心肌樣本投入4%戊二醛溶液中，待浸透樣本后行透射電鏡檢查。

1.5 TUNEL鑒定心肌細胞凋亡

將培養(yǎng)48 h的心肌組織經(jīng)0.1% Trition X-100透化后，漂洗3次，再滴加3%雙氧水H2O2200μl，漂洗后加入蛋白酶K工作液置于常溫下20 min。漂洗后加入TUNEL反應(yīng)液（TdT+熒光素標記的dUTP）37℃恒溫箱中避光孵育60 min；清洗后加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，最后用防熒光淬滅封片劑封片。隨機移動組織切片，選取細胞分布較均勻的高倍視野，計數(shù)＞1 000個。在相鄰的10個視野下，紅褐色細胞即陽性細胞。凋亡指數(shù)（AI）=各視野陽性細胞數(shù)/視野所有細胞總數(shù)×100%。

1.6 ELISA

采用ELISA法檢測各組小鼠左室心肌組織FFA、ATP、AMP、LAC、Col Ⅰ、Col Ⅲ及 NT-proBNP 的表達。于腹主動脈抽取2 ml動脈血置于促凝管中，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液進行NT-proBNP檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 Western blotting檢測

采用Western blotting檢測各組小鼠左心室心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白、鈣聯(lián)蛋白的表達。提取心室肌組織蛋白并測定濃度，取樣20μl以10%SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉，加一抗anti-GRP78（1 ∶ 1 000）、anti-CHOP（1 ∶ 1 000）、anti-骨膜蛋白（1∶500）、anti-鈣聯(lián)蛋白（1∶800） 4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，5 min/次。采用辣根過氧化酶標記二抗室溫孵育2 h，TBST洗脫3次，10 min/次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯像[8]。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟超聲檢查結(jié)果

對照組、模型組及低、中、高劑量組小鼠心臟LVEDd、LVEF及FS比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組 LVEDd較對照組擴大（P＜0.05），LVEF和FS減?。≒＜0.05）；低、中、高劑量組小鼠LVEDd、LVEF及FS較模型組有所改善，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表 1和圖 1。

表1 各組小鼠高頻心臟超聲數(shù)值變化 （n =10，±s）

表1 各組小鼠高頻心臟超聲數(shù)值變化 （n =10，±s）

注：1）與中劑量組比較，P ＜0.05；2）與低劑量組比較，P ＜0.05；3）與模型組比較，P ＜0.05；4）與對照組比較，P ＜0.05

組別 LVEDd/mm LVEF/% FS/%高劑量組 3.79±0.381） 83.49±4.241） 49.91±4.281）中劑量組 4.38±0.432） 79.52±4.622） 46.07±4.152）低劑量組 4.89±0.183） 74.75±3.643） 43.93±3.313）模型組 5.27±0.534） 67.31±5.734） 38.5±2.134）對照組 3.48±0.26 85.52±2.22 49.96±3.5 F值 16.581 19.360 26.780 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 小鼠心臟超聲檢查結(jié)果

2.2 各組小鼠心肌組織HE染色結(jié)果

模型組心肌纖維間隔較對照組增寬，細胞核排列紊亂，可見大量淋巴細胞浸潤。高、中、低劑量組小鼠心肌纖維間隔較模型組緊密，細胞核排列有改善趨勢，且呈劑量依賴性。見圖2。

2.3 各組小鼠心肌細胞透射電鏡結(jié)果

對照組心肌細胞肌纖維整齊，Z帶、M帶明顯，線粒體完整，且細胞內(nèi)無病毒跡象。模型組與照組比較，心肌細胞出現(xiàn)肌纖維溶解、異常收縮帶、線粒體空泡化等現(xiàn)象，并在細胞質(zhì)中出現(xiàn)直徑30～70μm二十面體病毒，符合CVB3病毒形態(tài)。低、中、高劑量組小鼠心肌細胞心肌纖維溶解現(xiàn)象較模型組減輕，線粒體趨于完整，病毒數(shù)量減少，且呈劑量依賴性。見圖3。

2.4 各組小鼠心肌組織AI比較

對照組、模型組,以及低、中、高劑量組小鼠心肌組織 AI分別為（3.26±0.85）、（76.39±5.14）、（39.66±4.87）、（26.42±2.74）、（15.43±1.74）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.786，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組心肌組織AI較對照組升高（P＜0.05）；低、中、高劑量組AI較模型組下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見圖4。

圖2 各組小鼠心肌組織 （HE×200）

圖3 各組小鼠心肌細胞 （透射電鏡×3 000）

圖4 各組小鼠心肌組織 （TUNEL×200）

2.5 各組小鼠心肌組織中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表達

對照組、模型組，以及低、中、高劑量組小鼠心肌組織中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組小鼠心肌組織中FFA、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ含量較對照組升高（P＜0.05），ATP/AMP比值降低（P＜0.05）；低、中、高劑量組心肌組織中FFA、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ含量較模型組降低，ATP/AMP比值升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組小鼠心肌組織中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表達比較 （n =10，±s）

表2 各組小鼠心肌組織中FFA、ATP/AMP、LAC、NT-proBNP、Col Ⅰ及Col Ⅲ的表達比較 （n =10，±s）

注：1）與中劑量組比較，P ＜0.05；2）與低劑量組比較，P ＜0.05；3）與模型組比較，P ＜0.05；4）與對照組比較，P ＜0.05

組別 FFA/（nmol/mg） ATP/AMP LAC/（nmol/mg） NT-proBNP/（ng/L） Col Ⅰ /（ng/mg） Col Ⅲ /（ng/mg）高劑量組 195.48±13.331） 8.57±0.691） 336.87±28.631） 449.78±42.351） 81.26±6.331） 55.11±3.311）中劑量組 227.28±11.152） 6.08±1.032） 376.39±21.392） 834.91±57.322） 90.46±6.282） 64.56±4.582）低劑量組 257.39±8.493） 4.63±0.363） 400.58±36.213） 1 168.36±85.223） 113.56±4.353） 73.64±4.363）模型組 277.63±15.274） 2.84±0.694） 468.94±29.884） 1 468.69±73.614） 124.63±9.684） 79.74±6.614）對照組 185.67±8.14 9.37±1.12 316.58±25.37 316.84±35.05 72.94±10.58 45.24±3.38 F值 53.786 12.674 32.482 73.496 22.64 26.763 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.006

2.6 各組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及鈣聯(lián)蛋白的表達

對照組、模型組，以及低、中、高劑量組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及鈣聯(lián)蛋白的表達比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表達較對照組升高（P＜0.05），鈣聯(lián)蛋白表達下降（P＜0.05）；低、中、高劑量組心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表達較模型組降低，鈣聯(lián)蛋白表達升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表3和圖5。

表3 各組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及鈣聯(lián)蛋白的表達比較 （n =10，±s）

表3 各組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及鈣聯(lián)蛋白的表達比較 （n =10，±s）

注：1）與中劑量組比較，P ＜0.05；2）與低劑量組比較，P ＜0.05；3）與模型組比較，P ＜0.05；4）與對照組比較，P ＜0.05

組別 GRP78 CHOP 骨膜蛋白 鈣聯(lián)蛋白高劑量組 0.24±0.011） 0.33±0.021） 0.21±0.001） 0.91±0.041）中劑量組 0.38±0.022） 0.39±0.052） 0.49±0.032） 0.58±0.042）低劑量組 0.64±0.053） 0.56±0.033） 0.71±0.053） 0.31±0.023）模型組 0.81±0.064） 0.84±0.054） 1.02±0.044） 0.22±0.034）對照組 0.07±0.01 0.36±0.02 0.26±0.02 1.23±0.07 F值 17.549 18.263 14.322 21.764 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白及鈣聯(lián)蛋白的表達

3 討論

氧化苦參堿又叫苦參素，是中藥苦參中的有效成分之一，具有多重生物效應(yīng)，如抗腫瘤、抗血管生成、保護血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)免疫等[8-10]。大量研究證實，氧化苦參堿可通過抑制二甲基精氨酸、凋亡相關(guān)因子的表達，減少心肌細胞凋亡，從而改善心衰大鼠心功能，抑制心室重構(gòu)[4-5]。但氧化苦參堿對病毒性心肌炎所致心衰的心肌能量代謝的影響未見報道。本研究對BALB/c小鼠腹腔無菌注射CVB3復(fù)制病毒性心肌炎所致心衰模型，并通過心臟多普勒彩色超聲及透射電鏡等途徑，從宏觀和微觀角度證實病毒性心肌炎所致心衰模型成立。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠注射CVB3病毒14 d后，心臟室壁變薄、LVEF下降、心腔擴大，符合心室重構(gòu)改變。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)出現(xiàn)直徑30～70 nm類似二十面體病毒，大量線粒體呈空泡化，說明病毒性心肌炎所致心衰小鼠模型成立，且CVB3病毒對線粒體完整性有一定影響。而應(yīng)用氧化苦參堿后，心臟超聲顯示心室重構(gòu)指標明顯改善，病毒數(shù)量減少，心肌細胞超微觀結(jié)構(gòu)有所改變，說明氧化苦參堿可能具有一定的抗病毒作用，減少心肌線粒體的破壞，改善心肌細胞能量供給，從而起到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用。這與楊志偉等[11]的研究結(jié)果有一定相似之處。

本實驗進一步觀察氧化苦參堿對病毒性心肌炎所致心衰小鼠心肌能量代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠心肌組織中FFA、LAC表達升高，ATP/AMP比值下降，其中LAC是FFA與葡萄糖酵解產(chǎn)物，兩者在心肌細胞內(nèi)過度堆積，可導(dǎo)致心肌細胞酸中毒，引發(fā)能量代謝紊亂及細胞凋亡[12-13]。而氧化苦參堿可使FFA、LAC含量下降，ATP/AMP比值上升，說明氧化苦參堿可能通過抗病毒，改善心肌細胞酸中毒，改善心肌細胞能量代謝，這可能是氧化苦參堿改善心衰的重要因素之一。SHIMAZAKI等[14]研究證實，骨膜蛋白在心肌病理狀態(tài)下，與膠原纖維的生成關(guān)系密切。而國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，骨膜蛋白可與Col Ⅰ直接交聯(lián)，加速細胞外基質(zhì)的整合與沉積，從而加速心肌纖維化程度[15]。鈣聯(lián)蛋白是Calnexin/Calreticulin循環(huán)的重要組成部分，具有多重生物學(xué)功能，其中調(diào)控蛋白折疊、裝配及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)是其主要功能[16]。鈣聯(lián)蛋白低表達可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊與錯誤折疊積聚過多，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）凋亡通路。本研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎心衰小鼠心室肌組織中GRP78、CHOP、骨膜蛋白表達升高，鈣聯(lián)蛋白表達下降，而氧化苦參堿可使GRP78、CHOP、骨膜蛋白表達下降，鈣聯(lián)蛋白表達上升。筆者認為，氧化苦參堿可能抑制心肌纖維化，增加心室肌順應(yīng)性，起到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)、改善心衰的作用，這一點也通過心室肌Col Ⅰ、Col Ⅲ結(jié)果得到證實。已有研究發(fā)現(xiàn)，ERS所引發(fā)的心肌細胞凋亡存在于病毒性心肌炎小鼠心肌內(nèi)[17]。結(jié)合本研究結(jié)果分析，氧化苦參堿抑制ERS細胞凋亡可能是通過增加鈣聯(lián)蛋白表達，延長鈣聯(lián)蛋白與未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白接觸時間，進而緩解ERS，挽救工作心肌細胞，達到改善心衰的目的。值得注意的是，CVB3病毒破壞心肌細胞線粒體，導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)供能不足，也可能導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)Ca2+紊亂及運轉(zhuǎn)能力不足，激發(fā)ERS所致心肌細胞凋亡，引發(fā)心衰，這部分研究筆者將在后續(xù)進一步研究中加以論證。

綜上所述，氧化苦參堿可能通過保護線粒體完整性、減輕心肌細胞ERS所致凋亡等機制，改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠心肌能量代謝，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，發(fā)揮抗心衰的作用。