李柏森，姜鶴群，文敏，易紅梅，李濤

[1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646099；2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 成都 610500；3.電子科技大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院(四川省癌癥防治中心)，四川成都 610041；4.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 胸心外科，四川 成都 610500]

約80%肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]，其預后差，總體生存率＜20%[2]。遠處轉移是NSCLC死亡的主要原因[3]。因此，深入闡明其發(fā)生、發(fā)展中的分子機制有巨大的現(xiàn)實意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA activated by transforming growth factor β, LncRNA-ATB）是一類轉錄本＞200 nt的幾乎不具有蛋白編碼能力的RNA[4]。近年來，許多LncRNA被證實在NSCLC侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而，LncRNA-ATB在NSCLC中的表達及功能尚未充分闡明。本研究擬探索LncRNA-ATB在NSCLC中的表達及其功能。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC和正常支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cells, HBEC）選取2012年3月7日—2015年5月8日在四川省腫瘤醫(yī)院就診的患者。NSCLC分為A549和HCI-H23細胞。用Trizol（美國Sigma公司）提取RNA，RNA逆轉錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Transwell小室（美國Millipore公司），基質膠（美國BD公司），螢光素酶報告基因檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及逆轉錄 將細胞鋪6孔板培養(yǎng)過夜至匯合度為80%，每孔加入1 ml Trizol裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，上清轉移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入75%乙醇1 ml，14℃、12 000 r/min離心5 min。所得沉淀加入20μl去離子水，即為所需RNA。

1.2.2 逆轉錄 將 1μl RNA，2μl 5× PrimeScript RT Master，7μl去離子水輕柔混勻后，進行逆轉錄反應。反應條件為：37℃15 min，85℃5 s，4℃儲存。

1.2.3 qRT-PCR 總反應體系25μl，具體如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5μl，正義鏈反義鏈引物各1μl，實時定量產物2μl，去離子水8.5μl。PCR反應條件為： 95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共30個循環(huán)。反應結束后樣品保存于4℃。采用 2-ΔΔCt法計算，LncRNA-ATB/microRNA-141（miR-141）相對表達量=2-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）待測樣本-（CTLncRNA-ATB/miR-141-CTU6）校準樣本。

1.2.4 Transwell實驗 在 Transwell下室中加入600μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（細胞侵襲實驗采用預先鋪好基質膠的Milipore小室，細胞轉移實驗采用Milipore小室），上室中加入200μl約2×105個細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄上室液體，小心取出小室，濕棉簽去除未穿過膜的細胞。甲醇固定2 min，結晶紫染色5 min，PBS洗滌，切下小室膜，封片。顯微鏡200倍視野下統(tǒng)計隨機10個視野的細胞數(shù)，拍照并繪制統(tǒng)計圖。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將NSCLC細胞鋪板，孵育過夜至細胞融合率達100%。用1 ml槍頭均勻地在細胞培養(yǎng)孔中劃痕，劃痕后用PBS洗滌細胞3次，加入不含血清的培養(yǎng)基，拍照，此時細胞間距離為0 h距離。置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次拍照，此時細胞間距離為24 h距離。細胞遷移距離為2次細胞間距離之差再除以2。

1.2.6 熒光素酶報告基因實驗 細胞培養(yǎng)過夜至匯合度達70%后，共轉染miR-141 mimics/miR-141 NC和pmiR-GLO-WT質粒。裂解細胞后，取10μl樣品加入100μl熒光素酶檢測試劑，上機測定熒光值。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，方差分析后的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA-ATB在NSCLC和HBEC細胞中的表達

qRT-PCR結果顯示，LncRNA-ATB在HBEC細胞中的相對表達量為（1.000±0.050），在NSCLC的A549細胞中相對表達量為（4.319±0.158），在NSCLC的NCI-H23細胞中相對表達量為（4.753±0.031）。經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.417，P=0.011）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，NSCLC的A549和NCI-H23細胞中LncRNA-ATB表達水平高于HBEC細胞（t=5.435和6.416，P=0.016和0.014）。見圖1。

圖1 NSCLC和HBEC細胞中LncRNA-ATB的表達水平比較 （±s）

本研究合成特異性沉默LncRNA-ATB表達的shRNA，qRT-PCR結果顯示，轉染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的相對表達量均為（1.000±0.050）；轉染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的相對表達量分別為（0.228±0.027）和（0.332±0.019），經t檢驗，兩組間LncRNA-ATB表達差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=5.731，P=0.021；NCI-H23：t=4.135，P=0.029）。LncRNA-ATB shRNA 可有效地沉默NSCLC細胞中LncRNA-ATB的表達（見圖2）。

2.2 LncRNA-ATB與NSCLC細胞轉移能力的關系

轉染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細胞的相對轉移細胞率為（100.0±5.0）%；轉染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細胞的相對轉移細胞率為（25.3±3.2）%和（30.9±3.8）%，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=4.332，P=0.033；NCI-H23：t=3.451，P=0.037），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC細胞的轉移能力。見圖3、4。

圖2 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的表達水平比較 （±s）

圖3 LncRNA-ATB促進NSCLC細胞轉移 （×200）

圖4 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞的相對轉移細胞率比較 （±s）

2.3 LncRNA-ATB與NSCLC細胞侵襲能力的關系

轉染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細胞的相對侵襲細胞率為（100.0±5.0）%；轉染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細胞的相對侵襲細胞率為（20.8±2.2）%和（24.9±1.7）%，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=5.482，P=0.017；NCI-H23：t=4.513，P=0.021），沉默 Lnc-ATB可抑制NSCLC細胞的侵襲能力。見圖5、6。

圖5 LncRNA-ATB促進NSCLC細胞侵襲 （×200）

圖6 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞的相對侵襲細胞率比較 （±s）

2.4 LncRNA-ATB與NSCLC細胞轉移距離的關系

轉染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細胞的相對轉移距離均為（1.000±0.050）μm；轉染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細胞的相對轉移距離為（0.423±0.024）和（0.381±0.029）μm，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=2.317，P=0.042，NCI-H23：t=2.726，P=0.039），沉默 Lnc-ATB可縮短NSCLC細胞的轉移距離。見圖7、8。

2.5 LncRNA-ATB在NSCLC細胞中吸附miR-141

生物信息學預測結果顯示，LncRNA-ATB存在miR-141結合位點。熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miR-141 NC和miR-141 mimics的pmirGLOLncRNA-ATB相對熒光強度分別為（1.000±0.050）和（0.346±0.029），經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.817，P=0.037），miR-141 mimics可特異性地與pmirGLO-LncRNA-ATB結合，并降低其熒光強度。見圖9。

圖7 LncRNA-ATB延長NSCLC細胞轉移距離 （×100）

圖8 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞的相對轉移距離比較 （±s）

圖9 兩組相對熒光強度比較 （±s）

2.6 LncRNA-ATB在NSCLC細胞中下調miR-141的表達

轉染miR-141 NC的A549和NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的相對表達量均為（1.000±0.050）；轉染miR-141 mimics的A549和NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的相對表達量分別為（1.032±0.019）和（0.983±0.029），經t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（A549：t=0.618，P=0.295；NCI-H23：t=0.561，P=0.332），轉染miR-141 mimics不能降低NSCLC細胞中LncRNA-ATB的表達水平（見圖10）。轉染LncRNA-ATB NC的A549和NCI-H23細胞中miR-141的相對表達水平均為（1.000±0.050）；轉染LncRNA-ATB shRNA的A549和NCI-H23細胞中miR-141的相對表達水平為（3.517±0.132）和（2.771±0.216），經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（A549：t=5.321，P=0.009；NCI-H23：t=4.316，P=0.015），沉默NSCLC細胞中LnRNA-ATB的表達可促進miR-141的表達（見圖11）。

圖10 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞中LncRNA-ATB的表達水平比較 （±s）

圖11 轉染LncRNA-ATB NC和LncRNA-ATB shRNA的A549、NCI-H23細胞中miR-141的表達水平比較 （±s）

3 討論

LncRNA在多種腫瘤中異常表達，并與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是近年來研究的熱點之一。LncRNA-ATB位于14號染色體（ENST00000493038），在肝細胞癌中表達上調，與肝細胞癌患者不良預后密切相關[7]。更為重要的是，多項研究表明lncRNAATB在胃癌[8]、結腸癌[9]、乳腺癌[10]及甲狀腺乳頭狀癌[11]等多種腫瘤中異常高表達，并與腫瘤侵襲、轉移密切相關。最新研究顯示，LncRNA-ATB在NSCLC組織中的表達異常升高，并與NSCLC患者不良預后密切相關[12]。本研究結果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細胞中的表達水平高于HBEC細胞。沉默NSCLC細胞中l(wèi)ncRNA-ATB的表達后，NSCLC的侵襲和轉移能力受抑制，提示lncRNA-ATB可能在NSCLC細胞中扮演抑癌基因的角色。

值得注意的是，一些IncRNAs可以作為競爭性內源性RNA（competing endogenous RNAs, ceRNA），通過與miRNA特異性地結合而調控其靶基因。研究顯示，LncRNA-HOTAIR可通過與miR-331-3p結合而調控HER2的表達，從而促進乳腺癌的進展[13]。LncRNAARSR可作為miR-34和miR-449的ceRNA，促進AXL和c-MET的表達，從而促進腎細胞癌細胞對舒尼替尼耐藥[14]。在肝細胞癌中，LncRNA-ATB可作為miR-200家族的ceRNA，調控ZEB1和ZEB2的表達[7]。本研究結果顯示，LncRNA-ATB可與miR-141特異性結合并調控其表達，提示LncRNA-ATB在NSCLC細胞中可能作為miR-141的ceRNA，調控NSCLC細胞的侵襲和轉移。

miR-141屬于miR-200家族。研究顯示，miR-200家族與腫瘤干細胞形成、上皮間質轉化關系密切[15]。在miR-200家族中，miR-200bc/429和miR-200a/141簇在序列上有高度同源性[16]。多項研究顯示，miR-200/141可抑制頭頸部鱗狀細胞癌、NSCLC、女性生殖系統(tǒng)腫瘤和腎細胞癌等多種腫瘤細胞的侵襲、轉移、增殖及耐藥[17-19]。更為重要的是研究顯示，在胃癌中LncRNA-ATB可與miR-141特異性結合，并降低其表達水平[20]。本研究結果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細胞中可特異性結合miR-141，并降低其表達水平，與既往研究結果一致。此外，本研究結果顯示，LncRNA-ATB可促進NSCLC細胞的侵襲和轉移。結合既往文獻，筆者推測LncRNA-ATB可能通過競爭性地與miR-141結合并促進其降解，而解除miR-141對下游靶基因的抑制，從而促進NSCLC細胞的侵襲和轉移。值得注意的是LncRNA-ATB在乳腺癌[10]、腎癌[14]、肝癌[7]等多種腫瘤細胞中高表達，并可通過上調ZEB1、c-MET等，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此LncRNA-ATB吸附miR-141僅為其促進NSCLC細胞侵襲和轉移的機制之一，更為復雜的作用機制仍需進一步研究證實。

綜上所述，本研究通過qRT-PCR檢測NSCLC和HBEC細胞中LncRNA-ATB的表達差異，發(fā)現(xiàn)LncRNA-ATB在NSCLC細胞中的表達水平高于HBEC細胞。沉默NSCLC細胞中LncRNA-ATB的表達后，NSCLC細胞的侵襲和轉移能力降低。研究結果顯示，LncRNA-ATB在NSCLC細胞中可吸附并下調miR-141的表達。本研究進一步明確NSCLC細胞侵襲和轉移的分子機制，有助于發(fā)現(xiàn)新的NSCLC靶向治療靶點。