吳少璞，祁亞偉，李學，楊紅旗，馬建軍

（河南省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450002）

帕金森病以多巴胺能神經(jīng)元減少為主要病理改變[1]。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line de-rived neurotrophic factor, GDNF）對退化的多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用[2]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine, MPTP）具有明顯的神經(jīng)毒性，目前廣泛用于復制帕金森病動物模型[3]。本文以MPTP誘導帕金森病模型小鼠作為研究對象，旨在探討GNDF對帕金森病形成相關(guān)因子酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）、Ephrin B2、磷酸化c-Jun（phos-phorylated c-Jun, p-c-Jun）的影響，為帕金森病的病理研究和臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

120只健康雄性SPF級小鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0009]，飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h晝夜循環(huán)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，小鼠體重（20±2）g。

1.2 實驗試劑

MPTP（美國ApexBio公司），GDNF（美國Thermo公司），水合氯醛溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司），GDNF（美國ProSpec公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海Biomiga公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）試劑盒（美國GeneCopoeia公司），免疫組織化學Ephrin B2和p-c-Jun一抗購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，抗兔IgG（二抗）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單側(cè)側(cè)腦室埋管術(shù) 所有實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后行右側(cè)側(cè)腦室埋管術(shù)。術(shù)前小鼠禁食12 h，采用水合氯醛400 mg/kg腹膜腔注射麻醉，待小鼠角膜反射消失提示麻醉完成。麻醉后切開小鼠頭部皮膚，暴露顱骨，采用三菱針穿刺顱骨表面右側(cè)側(cè)腦室代表區(qū)（具體位置為矢狀縫右側(cè)1.0 mm與前囟后0.3 mm交點），穿刺深度約為2.2 mm。穿刺后將不銹鋼外置管（長7.0 mm，外徑0.7 mm，內(nèi)徑0.5 mm）沿穿刺孔置入右側(cè)側(cè)腦室，采用101膠和牙托粉將外套管固定，外置管內(nèi)放置針芯避免外置管堵塞。術(shù)后3 d為恢復期，恢復期內(nèi)小鼠腹膜腔內(nèi)注射青霉素預防術(shù)后感染，注射量為2萬u/d。

1.3.2 帕金森病模型的復制 術(shù)后4 d隨機挑取84只小鼠復制帕金森病模型。小鼠腹膜腔注射MPTP 0.15 mg/10 g 10 d復制帕金森病模型[4]。剩余36只小鼠注射等量生理鹽水作為對照組。模型復制成功后觀察小鼠一般情況，觀察其有無動作遲緩、活動減少、尾部僵直等。最后77只小鼠模型復制成功，隨機選取72只并按隨機對照原則將其分為模型組和實驗組，每組36只。

1.3.3 側(cè)腦室注射 采用微量注射器通過外置管向小鼠右側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注入藥物，其中對照組和模型組注射生理鹽水1μl，實驗組小鼠注射GDNF生理鹽水1μl（GDNF溶解于生理鹽水中，濃度為1.0μg/μl），3次/d，連續(xù)注射10 d。

1.3.4 模型復制成功標準 每日觀察3組小鼠側(cè)腦室注射后的行為活動，并于側(cè)腦室注射第10天對3組小鼠進行不對稱旋轉(zhuǎn)行為檢測。具體方法：向模型動物頸部皮下注射0.05 mg/kg去水嗎啡（APO），誘導小鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，小鼠出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈行為后開始記錄小鼠30 min內(nèi)轉(zhuǎn)圈數(shù)，并算出平均值，平均轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7次/min則視為帕金森病小鼠模型復制成功。

1.4 觀察指標

1.4.1 多巴胺能神經(jīng)元數(shù)和Ephrin B2、p-c-Jun蛋白 每組隨機選取24只小鼠，麻醉后采用40 g/L多聚甲醛對小鼠腦組織進行灌注固定，取出小鼠腦組織后放入40 g/L多聚甲醛，在4℃環(huán)境下固定過夜。將腦組織置于20%蔗糖溶液中沉底，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中沉底，將含有黑質(zhì)的腦組織進行冠狀面冷凍切片，切片厚度1 mm，樣品在-80℃冰箱內(nèi)保存。將其中12只小鼠中含有黑質(zhì)、紋狀體部位的腦片進行TH染色，采用光學分流閥計算TH陽性神經(jīng)元數(shù)。將另外12只小鼠腦片中包含黑質(zhì)的腦片進行SP免疫組織化學染色，檢測3組小鼠黑質(zhì)中Ephrin B2和p-c-Jun蛋白表達水平，按照試劑盒說明書進行操作，其中陰性對照一抗用磷酸鹽緩沖液代替，其余方法相同。用顯微鏡進行觀察，陽性細胞呈棕黃色。每個腦片中隨機選取5個視野計算陽性細胞數(shù)。

1.4.2 腦黑質(zhì)TH mRNA 每組隨機選取12只小鼠，快速斷頭后于冰上將小鼠黑質(zhì)部位分離出，置入液氮中進行保存，供qRT-PCR使用。提取小鼠黑質(zhì)總RNA，采用Trnizol試劑，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。采用qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行檢測。GAPDH正向引物：5'-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3’，反向引物：5’-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTT-3’，產(chǎn)物長度為351 bp；TH正向引物：5’-GGTATACGAC ACGCTGAAGG-3’，反向引物：5’-TAGCCACAGTA CCGTTCCAGA-3’，產(chǎn)物長度為90 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性2 min；94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；熔解曲線：95℃1 min，55℃1 min，55～98℃（10 s/循環(huán)，0.5℃/循環(huán)）86個循環(huán)。計算各樣品ΔCt值，以對照組為校正樣品，計算目的基因相對表達量。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，qRT-PCR重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，或重復測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GDNF對小鼠行為學的影響

所有小鼠側(cè)腦室埋管成功，全部存活。3組小鼠模型復制后、注射后5和10 d的轉(zhuǎn)圈數(shù)比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點小鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)有差異（F=273.454，P=0.000）；②3組小鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)有差異（F=484.573，P=0.000）。③3組小鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)變化趨勢有差異（F=321.234，P=0.000）。見表1。

表1 3組小鼠不同時間點的轉(zhuǎn)圈數(shù)比較（n =36，r/30 min，±s）

表1 3組小鼠不同時間點的轉(zhuǎn)圈數(shù)比較（n =36，r/30 min，±s）

組別 模型復制后 注射后5 d 注射后10 d對照組 2.7±1.4 2.5±1.7 2.5±1.5模型組 211.7±21.4 218.5±22.3 210.7±24.4實驗組 227.5±27.4 163.4±18.4 142.6±19.5

2.2 GDNF對小鼠多巴胺能神經(jīng)元數(shù)的影響

對照組小鼠健側(cè)與毀損側(cè)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)（TH陽性）比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組、實驗組健側(cè)與毀損側(cè)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），損毀側(cè)少于健側(cè)。3組健側(cè)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3組損毀側(cè)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組＜實驗組＜對照組。見表2。

表2 3組小鼠多巴胺能神經(jīng)元數(shù)比較（n =12，個，±s）

表2 3組小鼠多巴胺能神經(jīng)元數(shù)比較（n =12，個，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 健側(cè) 毀損側(cè) t值 P值對照組 219.1±18.9 228.5±15.3 1.328 0.198模型組 211.4±19.5 86.5±17.31） 16.600 0.000實驗組 220.4±21.9 157.5±22.91）2） 7.965 0.000 F值 1.404 85.862 P值 0.252 0.000

多巴胺能神經(jīng)元經(jīng)DBA顯色后呈現(xiàn)棕褐色。對照組損毀側(cè)神經(jīng)元與健側(cè)比較，無明顯差異；模型組和實驗組損毀側(cè)神經(jīng)元數(shù)較健側(cè)明顯減少。見圖1。

2.3 GDNF對小鼠黑質(zhì)TH mRNA表達的影響

qRT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。以對照組（1.00±0.00）作為矯正，模型組和實驗組TH mRNA相對表達量分別為（0.82±0.07）和（0.97±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=3899，P=0.000），對照組＞實驗組＞模型組（見圖3）。

2.4 GDNF對小鼠黑質(zhì)Ephrin B2、p-c-Jun蛋白表達的影響

3組小鼠黑質(zhì)Ephrin B2陽性神經(jīng)元數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組高于對照組和實驗組。3組小鼠黑質(zhì)p-c-Jun陽性神經(jīng)元數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組高于對照組和實驗組。見表3。

圖1 GDNF對MPTP誘導帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元數(shù)的影響 （SP×20）

圖2 小鼠腦黒質(zhì)中TH mRNA的表達

圖3 各組小鼠黑質(zhì)TH mRNA表達水平比較（n =12，±s）

表3 3組小鼠黑質(zhì)Ephrin B2、p-c-Jun陽性神經(jīng)元數(shù)比較 （n =12，個，±s）

表3 3組小鼠黑質(zhì)Ephrin B2、p-c-Jun陽性神經(jīng)元數(shù)比較 （n =12，個，±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05

組別 Ephrin B2陽性 p-c-Jun陽性對照組 10.2±2.4 9.8±1.8模型組 13.8±2.4? 32.3±6.5?實驗組 10.9±2.7 15.6±2.1 F值 7.160 99.128 P值 0.003 0.000

3 討論

帕金森病是老年人常見疾病，帕金森病主要的病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，紋狀體DA含量下降。帕金森病的治療目前主要以口服多巴胺制劑為主，雖然具有一定臨床效果，但是不能從根本上解決多巴胺能神經(jīng)元的喪失[5]。GDNF具有促進神經(jīng)細胞生長、分化、再生及修復的作用，補充GDNF是目前治療帕金森病的輔助手段之一，能夠延緩疾病的進展，減少神經(jīng)細胞退變[6]。動物實驗證實，GDNF能夠促進多巴胺能神經(jīng)元分化，提高多巴胺能神經(jīng)元存活，對神經(jīng)具有保護和修復作用[7]。MPTP具有高親脂性，能夠透過血腦屏障進入腦內(nèi)，經(jīng)過代謝后會產(chǎn)生1-甲基-4-本基吡啶離子（MPP+），MPP+能夠損毀黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元，造成多巴胺含量降低。此外，MPTP代謝產(chǎn)物能夠?qū)Χ喟桶泛铣傻南匏倜窽H產(chǎn)生抑制作用，從而降低多巴胺的合成[8]。目前復制動物模型的常用方法包括神經(jīng)毒素誘導、轉(zhuǎn)基因、基因敲除等，其中采用MPTP誘導的帕金森病動物模型具有與人帕金森病類似的癥狀、病理改變，且癥狀相對穩(wěn)定、成本較低[9]。小鼠對MPTP較為敏感，因此本研究采用腦內(nèi)注射MPTP復制帕金森病小鼠模型。

本研究中模型組黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)與對照組相比明顯降低，實驗組注射GDNF后黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)高于模型組。結(jié)果說明實驗組動物神經(jīng)損傷程度高于對照組，低于模型組，GNDF對帕金森病小鼠的神經(jīng)損傷有改善，能增加TH陽性神經(jīng)元數(shù)，提高神經(jīng)纖維密度。有研究認為，GDNF具有神經(jīng)元保護作用主要與GDNF受體家族α1（GFR-α-1）和Ret受體有關(guān)，其中GFR-α-1是一個配體、受體復合體，是磷脂酰肌醇錨定到細胞表面上的蛋白質(zhì)分子[10]；Ret是一個受體酪氨酸激酶，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，GDNF能夠與GFR-α-1特異性結(jié)合，同時Ret被磷酸化，并將信號轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，激活絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C等，從而激活細胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用[11]。

TH是多巴胺合成第一步的限速酶，根據(jù)相關(guān)研究，帕金森病患者TH含量明顯降低[12]。研究顯示，帕金森病動物模型腦組織中TH mRNA表達量較正常組低，說明帕金森病的發(fā)生與TH的失活密切相關(guān)[13]。TH可以間接反映多巴胺能神經(jīng)元的存活狀態(tài)，因此可以將TH作為反映多巴胺能神經(jīng)元存活的蛋白標志物[14]。本研究通過檢測TH mRNA表達量反映TH表達的穩(wěn)定性。本研究中，模型組小鼠TH mRNA表達量較對照組和實驗組低，而實驗組TH mRNA表達量相比對照組無明顯差異。研究結(jié)果表明，GDNF能夠提高帕金森病模型小鼠TH的表達水平。陳立等[15]的研究表明，GDNF能夠提高體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞TH表達量，與本研究結(jié)果相符。說明GDNF能夠?qū)κ軗p多巴胺能神經(jīng)元進行修復，提高TH mRNA的表達。

Ephrin B2是受體酪氨酸激酶亞家族Eph的配體，參與神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育，與細胞遷移、軸突導向、神經(jīng)環(huán)路合集、突出信息等關(guān)系密切[16-17]。Ephrin B2參與神經(jīng)性疼痛及炎癥性調(diào)控。相關(guān)研究顯示，在神經(jīng)元受損時，Ephrin B2表達水平升高[18]。本研究中，模型組小鼠Ephrin B2水平明顯高于對照組，可能與MPTP引起多巴胺能神經(jīng)元損傷有關(guān)。多巴胺能神經(jīng)元壞死后引起局部炎癥反應(yīng)，導致局部Ephrin B2表達升高。本研究中，實驗組小鼠Ephrin B2表達低于模型組，分析其原因可能為GDNF通過下調(diào)Ephrin B2的表達，降低因MPP+對神經(jīng)元產(chǎn)生的損傷及誘導的炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)受損，有利于多巴胺能神經(jīng)元的修復。

c-Jun是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于亮氨酸拉鏈家族成員，其磷酸化后會引起神經(jīng)興奮性中毒或神經(jīng)元的死亡。c-Jun氨基末端激酶（JNK）屬于促分裂原活化蛋白激酶家族（MAPK），其活化后能引起c-Jun磷酸化。相關(guān)研究顯示，MPTP引起的神經(jīng)元死亡主要是通過JNK信號通路實現(xiàn)的，MPP+能夠引起c-Jun磷酸化形成p-c-Jun，并且使其表達量升高，從而激活JNK傳導通路，引起神經(jīng)元損傷[19]。研究顯示，MPTP能夠使小鼠腦組織中c-Jun蛋白磷酸化，磷酸化部位以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元為主[20]。本研究中，模型組小鼠紋狀體中p-c-Jun高于對照組。實驗組小鼠p-c-Jun低于模型組，說明GDNF能夠減小MPTP對c-Jun產(chǎn)生的磷酸化作用，從而降低p-c-Jun水平，避免引起JNK信號通路紊亂，發(fā)揮保護多巴胺能神經(jīng)元的作用。

綜上所述，GDNF能夠提高MPTP誘導帕金森病模型小鼠黑質(zhì)TH的表達，降低Ephrin B2和p-c-Jun蛋白的表達，進而對小鼠多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用，提示GNDF可能在治療人帕金森病上具有一定價值。