趙軍 孫菲菲 施健 唐艷 吳笛 邱金紅 朱愛華 張魯平

耳聾是臨床上常見的遺傳病之一，其中50%以上由遺傳因素所導(dǎo)致，即遺傳性聾[1]。遺傳性聾具有高度異質(zhì)性，至今已有130余個耳聾基因被克隆或鑒定(http://hereditaryhearingloss.org)。如何快速精準(zhǔn)完成耳聾患者的基因診斷，特別是為嬰幼兒耳聾患者明確病因，為耳聾家庭提供行之有效的精準(zhǔn)化預(yù)防和診治方案，是臨床工作中的一大挑戰(zhàn)和難點。本研究以耳聾家庭為單位，使用兩步法模式(微陣列芯片法+高通量基因捕獲技術(shù)方法)，明確了14個耳聾家庭的遺傳病因，結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究14個耳聾家庭的14例先證者皆因雙側(cè)不同程度的感音神經(jīng)性聾就診于南通大學(xué)附屬醫(yī)院耳科門診(2017年3月至2018年4月)，其中12個家庭的父母聽力正常，2個家庭的父母為聾啞人，均為非近親結(jié)婚。對14個家庭進行了詳細的病史采集包括：聽力障礙的起始年齡及誘因、進展情況、有無耳鳴、眩暈等伴隨癥狀、既往有無系統(tǒng)性疾病、耳毒性藥物應(yīng)用史及噪聲接觸史等，進行全身體檢排除綜合征型遺傳性聾，并進行聽力學(xué)檢查及顳骨高分辨率CT掃描。本研究得到受試者的知情同意及南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會倫理論證認可。

1.2聽力學(xué)檢查及聽力學(xué)表型的分析 對納入研究的耳聾患者進行如下檢查:①純音聽閾檢測(適用于配合良好、大于4歲的患者)；②聲導(dǎo)抗檢查；③畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射 (DPOAE)檢測；④聽性腦干反應(yīng)(ABR)及聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)(auditory steady-state responses, ASSR)測試, 用于年齡≤4歲患者；綜合上述檢查確定聽力損失程度。以較好耳0.5、1.0、2.0及4.0 kHz四個頻率的平均聽閾判斷聽力損失程度： 20～40 dB HL為輕度聽力損失；41～70 dB HL為中度，71～95 dB HL為重度；>95 dB HL為極重度。根據(jù)家系調(diào)查和聽力結(jié)果繪制系譜圖。

1.3候選致病基因突變篩查 家系成員均抽取外周靜脈血2 ml (采血管含EDTAK2抗凝劑)，提取基因組DNA備用。實驗方法同參考文獻[2,3]：①采用晶芯15項遺傳性聾基因檢測試劑盒(微陣列芯片法)，檢測樣本4個基因的15個常見突變位點：GJB2(35delG、235delC、176del16、299delAT)、 SLC26A4(2168A>G、919-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、IVS15+5 G>A)、線粒體12S rRNA(1555A>G、1494C>T)和GJB3(538C>T)。將基因芯片未能確診的陰性突變患者，通過北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司開發(fā)的耳聾芯片，定向捕獲所有已知的及相關(guān)的耳聾基因的外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列，經(jīng)二代測序數(shù)據(jù)分析后得到疑似致病基因突變位點；②常規(guī)Sanger測序方法驗證；③驗證突變位點在家庭成員中與耳聾表型的共分離情況。

2 結(jié)果

2.114個家庭耳聾患者的診斷及干預(yù) 本研究14個家庭共51人，20人耳聾，系譜分析均符合常染色體隱性遺傳特征。經(jīng)詳細的病史詢問及體格檢查，確診的20例感音神經(jīng)性聾患者，年齡6個月～72歲，聽力損失從中度、重度到極重度不等(表1)，雙側(cè)基本對稱； 5例自訴有耳鳴病史。20例耳聾患者其他系統(tǒng)均未見異常，無耳毒性藥物接觸史和噪聲接觸史，無新生兒期聽力損失高危因素及智力障礙。14例先證者(HM1～14)均行顳骨高分辨率CT掃描，10個家庭的先證者(HM1～9、14)未發(fā)現(xiàn)中耳、內(nèi)耳結(jié)構(gòu)異常及內(nèi)聽道的占位病變，4個家庭的先證者(HM10～13)證實有雙側(cè)前庭水管擴大。其中6例先證者已行單側(cè)人工耳蝸植入術(shù)，HM1、7、10～12家庭的5個患兒開機后對聲音反應(yīng)好，術(shù)后都不到一年，目前在進行聽覺言語康復(fù)；HM13家庭的患者自幼佩戴助聽器，雙側(cè)聽力損失漸進性加劇，14歲時發(fā)展至雙側(cè)極重度聾，行右側(cè)人工耳蝸植入術(shù)，目前該患者能夠進行正常的言語交流。HM5、8、9先證者佩戴助聽器，其中HM8先證者自幼佩戴助聽器，言語發(fā)育尚可，能進行簡單的日常會話，自訴有耳鳴且雙側(cè)聽力損失近年來有加重趨勢。

2.2候選致病基因篩查結(jié)果 14例先證者采用十五項遺傳性聾基因診斷芯片檢測結(jié)果見表1，①明確了8例先證者的遺傳學(xué)診斷，其中6例為GJB2雙等位基因突變，2例為SLC264雙等位基因突變；8例后續(xù)經(jīng)常規(guī)Sanger測序方法驗證，準(zhǔn)確率達到100%；②檢測到1例GJB2、2例SLC264單等位基因突變；③3例未能檢測出突變位點。

對6例未能確診的先證者，進一步使用定向捕獲聯(lián)合二代測序技術(shù)進行耳聾基因檢測，結(jié)果如下：①GJB2雙等位基因突變3例：HM5家庭的先證者為c.235delC/c.380G>T，HM6家庭為c.109G>A/c.571T>C(圖1)，HM9家庭雙基因致病為GJB2 c.109G>A純合+TBC1D24 c.1156T>C雜合(圖2)；②SLC26A4雙等位基因突變2例：HM12家庭的先證者是 c.919-2A>G/c.2167C>G(圖3); HM13家庭為c.626G>A/c.2168A>G；③HM14家庭的先證者為相對少見的耳聾基因MYO15A突變：c.6956+9C>G/c.10245_10247delCTC(圖4)。除HM5、6兩個家庭外，其余12個家庭先證者的雙等位基因變異經(jīng)常規(guī)Sanger測序方法驗證，均分別來自于父母親。

表1 14個耳聾家庭先證者年齡、性別、突變基因、突變位點及聽力損失程度

注：a：芯片檢出的突變；b：二代測序檢出的突變；(-)：未能采集到父母雙親的血樣，不能明確突變的來源；Splicing：剪切突變； *：移碼后遇到終止密碼子時會用*號提示終止密碼子的位置，如p.L79Cfs*3表示堿基缺失發(fā)生移碼，后面的堿基補上來開始進行編碼，編碼到第3個氨基酸的時候是終止密碼子。R/L：右耳/左耳

3 討論

圖1 HM6耳聾家庭的家系圖及突變峰圖

本研究14個耳聾家庭中，9個家庭明確為GJB2雙等位基因突變致病，其中8個家庭先證者的聽力學(xué)表型都為先天性聾或語前聾，只有一個家庭先證者表現(xiàn)為語后聾或漸進性聽力下降；且3個家庭的基因型和聽力學(xué)表型至今都無報道：①HM5家庭先證者的基因型為復(fù)合雜合變異c.235delC/c.380G>T，在國內(nèi)，尤其是本研究所在的地區(qū)，c.235delC是GJB2最常見的致病變異位點[3,4]，而國內(nèi)外尚無c.380G>T(p.R127L)變異引起耳聾的病例報道。最近有研究證實p.R127L具有致病性[5]，HM5家庭的先證者已有9月齡，為雙側(cè)中度感音神經(jīng)性聾，進一步證實了p.R127L為致病性變異。HM5家庭的先證者為先天性聾啞，但其父母拒絕基因檢測，故不能明確其父母是否同為GJB2基因突變的同證結(jié)婚。②HM6家庭先證者的突變?yōu)閏.109G>A/c.571T>C，該家系有兩人患病，起病年齡都在35歲以后，漸進性加劇，都伴有耳鳴。目前已明確c.109G>A(p.V37I)是致病變異[6]；而對于c.571T>C(F191L)，Ambros等[7]進行GJB2不同突變體的體外功能表達研究發(fā)現(xiàn)：F191L突變體可導(dǎo)致GJB2編碼的縫隙連接蛋白Cx-26的運輸功能異常。由于F191L為罕見變異，文獻中未見F191L純合和復(fù)合雜合突變致聾的病例報道，故對于F191L是否為致病性變異，目前尚無定論。本研究發(fā)現(xiàn)F191L高度保守、生物學(xué)分析提示該變異具有致病性、在家庭HM6共分離，同時結(jié)合Ambros的體外功能實驗，高度提示F191L為致病性變異。③HM9家庭的先證者很可能為雙基因致?。篏JB2 (c.109G>A, p.V37I純合) + TBC1D24(p.C386R,雜合)。p.V37I純合變異大都引起遲發(fā)性輕度-中度的語后聾，隨年齡增長漸進性加劇[3,8]；但本研究中HM9家庭的先證者目前僅7歲，為先天性中度語前聾。Chai等[8]曾發(fā)現(xiàn)一例由GJB2 (p.V37I)純合突變+CDH23 (p.Y1995X)純合變異引起的極重度耳聾患兒；與Chai的報告類似，本研究中的該例先證者攜帶雙基因變異；不同的是HM9的先證者攜帶的另外一個耳聾基因是TBC1D24，本研究團隊先前已證實一常染色體顯性遺傳的非綜合征型聾大家系的致病基因及其突變位點是TBC1D24雜合突變p.S178L[9]。HM9的先證者攜帶的TBC1D24雜合突變p.C386R是新生變異，該突變位點高度保守、生物學(xué)分析高度提示該變異具有致病性，結(jié)合先前的報告，推測HM9的先證者可能是雙基因變異導(dǎo)致的中度聾(圖2)。

圖2 HM9耳聾家庭的家系圖及突變峰圖

圖3 HM12耳聾家庭的家系圖、突變峰圖以及CT圖

圖4 HM14耳聾家庭的家系圖及突變峰圖

SLC26A4基因的突變范圍幾乎涉及該基因所有編碼區(qū)域，除了少數(shù)的熱點變異，尚有近200種相對少見的變異位點，包括大片段的缺失[3,10,11]，本研究的兩步法策略成功明確了4個耳聾家庭為SLC26A4基因變異致病。值得一提的是，HM12、13兩個家庭從正反兩方面闡明了先天性聾一級預(yù)防的重要性、迫切性及其現(xiàn)實意義[12]：①HM12家庭先證者的父母親均為大前庭水管綜合征導(dǎo)致的先天性聾啞，屬于同一耳聾基因變異的聾人與聾人相結(jié)合的同證婚配(圖3)，所以理論上他們的后代百分之百是先天性耳聾患者；如果他們婚前能夠明確基因診斷，進行遺傳咨詢，可以減少聾兒的出生；② HM13家庭的先證者攜帶復(fù)合雜合突變c.626G>A/c.2168A>G，其未婚夫聽力正常，卻攜帶雜合c.919-2A>G，對這個家庭進行精準(zhǔn)的耳聾遺傳咨詢及產(chǎn)前指導(dǎo)，可以有效避免聾兒后代的出生。

本研究中，對于十五項遺傳性聾基因芯片檢測結(jié)果為單等位基因變異或者陰性的家庭，通過高通量基因捕獲技術(shù)做了進一步的耳聾基因檢測：一方面發(fā)現(xiàn)了上述常見耳聾基因罕見的突變位點；另一方面還發(fā)現(xiàn)了相對少見的耳聾基因及其變異：耳聾芯片檢測陰性的家庭HM14明確為MYO15A基因變異(c.6956+9C>G/c.10245_10247delCTC)；在韓國的常染色體隱性非綜合征型聾患者中MYO15A基因是僅次于GJB2、SLC26A4及CDH23的第四大致聾基因[13]；在我國也有報道，MYO15A基因突變引起的耳聾，均為雙側(cè)重度-極重度感音神經(jīng)聾[14～17]。文中HM14家庭的兩例患者都為聾啞人，為雙側(cè)先天性極重度感音神經(jīng)性聾，首先，盡管該復(fù)合雜合突變至今無報道，但是上述兩個變異在既往文獻中均有報道， c.6956+9C>G屬于移碼突變[14]，c.10245_10247delCTC屬于小片段缺失，導(dǎo)致3416位少了一個絲氨酸(S)[13]；其次該突變在HM14家庭共分離；且未發(fā)現(xiàn)其他可疑的致病變異，與MYO15A的隱性遺傳方式一致。以上基本明確了HM14家庭的遺傳病因，同時該家庭的兩例耳聾患者已到婚育年齡，今后從重點懷疑和高危人群耳聾基因篩查的一級預(yù)防著手，可以從根本上阻斷該家庭先天性耳聾的遺傳。

目前，耳聾基因檢測有多種方法[3,9,18，19]，本研究改進了先前的檢測策略[3]，以每個耳聾家庭為單位，使用兩步法成功鑒定出14個耳聾家庭的致聾基因及其突變位點，先使用十五項遺傳性聾基因診斷芯片成功鑒定出8個耳聾家庭的遺傳病因，(GJB2變異引6個，SLC26A4 突變2個，檢出率為(57%，8/14)，這8例后續(xù)經(jīng)常規(guī)Sanger測序方法驗證，準(zhǔn)確率達到100%。耳聾基因芯片技術(shù)快速、操作簡便、檢測成本低、檢出率高及準(zhǔn)確率高，應(yīng)結(jié)合本地區(qū)耳聾群體中基因突變譜的特點[3]，首選基因芯片技術(shù)進行耳聾基因檢測。對于上述檢測不能明確基因診斷的，再以家庭為單位，應(yīng)用高通量測序技術(shù)，對每個耳聾家庭的患者及正常對照者攜帶的變異信息進行甄別，從候選的變異信息中篩選出真正的致病變異，最終找出與耳聾表型共分離的基因變異。

綜上所述，本研究以每個耳聾家庭為單位的二步法基因檢測模式，成功鑒定出14個非綜合征型聾家庭的致病基因及其突變位點，豐富了本地區(qū)的遺傳性耳聾基因突變譜，獲得了上述突變基因型相對應(yīng)聽力學(xué)表型的寶貴臨床資料，同時為這些耳聾家庭提供了個體化精準(zhǔn)服務(wù)，取得了良好的經(jīng)濟及社會效益，值得推廣和應(yīng)用。