王正娟，蘇柳如，葉秀云，林 娟，楊 捷

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

0 引言

齒毛菌屬(Cerrenasp.)隸屬擔(dān)子菌綱(Bssidiomycetes)多孔菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)，作為一種藥用真菌，它的次生代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、抗癌等生物活性，同時(shí)能高效分泌漆酶[1].漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，可催化酚類、多環(huán)芳烴類、甾體激素、生物色素等多種底物氧化，將電子轉(zhuǎn)移至分子氧，生成唯一的副產(chǎn)物水分子[2].漆酶作為一種高效、環(huán)保的生物催化酶類，在紡織、造紙、食品、有機(jī)物合成、生物降解、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值[3].

雖然擔(dān)子菌綱白腐真菌是最主要的漆酶生產(chǎn)者[4]，但是真菌漆酶的產(chǎn)量在不同種屬和菌株有所不同，大部分野生型菌株漆酶產(chǎn)量低，產(chǎn)酶周期長[3].因此，對(duì)產(chǎn)漆酶菌株的產(chǎn)酶機(jī)制進(jìn)行解析及改造，獲得漆酶高產(chǎn)菌株對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義.

絲狀真菌常見的遺傳改造方法，如紫外誘變、基因?qū)?、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等由于細(xì)胞壁的存在導(dǎo)致改造效率低[5].因此既無細(xì)胞壁阻礙、又保持細(xì)胞完整性且具有優(yōu)良再生性能的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法成為了絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)先選擇.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法已被廣泛應(yīng)用于多種真菌的遺傳操作中，如重傘靈芝(Ganodermamultipileum)[6]、炭黑曲霉菌(Aspergilluscarbonarius)[7]、黑粉菌(Ustilagoesculenta)[8]等.但是由于不同菌株的細(xì)胞壁組成有很大不同，甚至同一菌株不同部位的組成也有所不同，因而原生質(zhì)體的制備沒有標(biāo)準(zhǔn)化的方法，也沒有普遍適用的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[9].

實(shí)驗(yàn)室前期獲得的Cerrenasp.HYB07菌株，具有漆酶產(chǎn)量高，產(chǎn)酶周期短的特性.本實(shí)驗(yàn)以該菌株為研究對(duì)象，潮霉素B抗性基因Hyg作篩選標(biāo)記，探究影響齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的多個(gè)重要因素，建立PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化菌株.

1 材料與方法

1.1 材料

齒毛菌Cerrenasp.HYB07菌株，由福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏； pCAMBIA1302質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,Hyg)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因.

1.2 試劑

溶壁酶購自廣東微生物研究所； 潮霉素B購自瑞士Roche公司； 真菌DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司； 2×Easy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司； 其余試劑均為分析純.

1.3 原生質(zhì)體制備

1) 培養(yǎng)基制備.PDA培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[10]制備.YSJ培養(yǎng)基[11]： 麥芽糊精60 g，蛋白胨15 g，KH2PO46 g，MgSO4·7H2O 4.14 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.062 5 g，ZnSO4·7H2O 0.018 g，VB10.015 g，定容至1 L，pH值范圍4.5～4.8，121 ℃，滅菌30 min.

再生培養(yǎng)基1號(hào)： PDA培養(yǎng)基添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，121 ℃，滅菌20 min； 再生培養(yǎng)基2號(hào)： YSJ培養(yǎng)基添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，121 ℃，滅菌20 min； 再生培養(yǎng)基3號(hào)[12]： 馬鈴薯葡萄糖水24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖10 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.2 g，瓊脂粉15 g，添加穩(wěn)滲劑至終濃度為0.8 mol·L-1，定容至1 L，121 ℃，滅菌20 min.

2) 菌絲培養(yǎng)方法.取PDA斜面保藏菌種，PDA平板劃線30 ℃活化培養(yǎng)4 d，以直徑0.5 cm打孔器打孔，取3個(gè)菌餅至50 mL PDA一級(jí)種子液，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2 d； 以6%～8%的接種量接一級(jí)種子液至100 mL二級(jí)種子液，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2 d.

3) 原生質(zhì)體制備.取30 mL培養(yǎng)2 d的二級(jí)種子液于50 mL無菌離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，棄上清； 無菌水洗滌一次； 穩(wěn)滲劑洗滌一次； 無菌濾紙濾干水分； 準(zhǔn)確稱取0.2 g菌絲于4 mL離心管中，加入2 mL一定質(zhì)量濃度溶壁酶(穩(wěn)滲劑溶解溶壁酶干粉，0.22 μm無菌濾膜過濾)，在一定溫度下80 r·min-1振蕩酶解一定時(shí)間； 無菌注射器(內(nèi)塞有滅菌脫脂棉)過濾除菌絲，濾液在4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，棄上清； 沉淀用穩(wěn)滲劑重懸洗滌2次； 加1 mL 0.6 mol·L-1的甘露醇重懸原生質(zhì)體.

4) 原生質(zhì)體再生.顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原生質(zhì)體懸液中的原生質(zhì)體形成數(shù)(M)，取0.1 mL原生質(zhì)體懸液輕輕涂布于再生培養(yǎng)基平板上，30 ℃暗箱培養(yǎng)6～8 d，菌落長出后計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)(A).同時(shí)，以用無菌水稀釋的原生質(zhì)體懸液為對(duì)照組，計(jì)數(shù)再生平板菌落(B).

5) 不同因素對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響.采用不同菌齡(24、36、48、60、72 h)的二級(jí)種子液菌絲為原料； 選用不同種類穩(wěn)滲劑(0.6 mol·L-1甘露醇、0.6 mol·L-1蔗糖、0.6 mol·L-1KCl)； 以不同質(zhì)量濃度(10、15、20、25、30 mg·mL-1)溶壁酶，在不同溫度(20、25、30、35、40 ℃)下，酶解不同時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)制備原生質(zhì)體； 并在不同種類再生培養(yǎng)基(1、2、3號(hào))上再生培養(yǎng).探索不同因素對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響.

1.4 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

1) 潮霉素B敏感性實(shí)驗(yàn).原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化前配制含有0、10、20、30、40、50 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板，涂布1 000 μL齒毛菌二級(jí)種子液菌絲，30 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后觀察菌絲生長情況，以確定潮霉素B對(duì)齒毛菌HYB07的最低抑制濃度.

2) 齒毛菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化.參照Subburaj 等[13]和Yu等[8]的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，并加以改良.將新鮮制備的原生質(zhì)體懸浮于MTC(0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1Tris-HCl、pH值為6，10 mmol·L-1CaCl2)緩沖液中，使原生質(zhì)體數(shù)目為1×108個(gè)·mL-1； 每100 μL MTC原生質(zhì)體懸浮液加入1 μg線性化質(zhì)粒pCAMBIA1302、50 μL PEG緩沖液(400 mg·mL-1PEG 4000以MTC緩沖液溶解，0.22 μm無菌濾膜過濾)，冰浴30 min； 加入1 mL PEG緩沖液，25 ℃水浴15 min.將混合液加入5 mL液體再生培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)12 h后涂布于含最低抑制濃度潮霉素B的再生平板上； 30 ℃培養(yǎng)，待菌落再生后挑取單菌落于潮霉素B抗性PDA平板上復(fù)篩.

3) 齒毛菌轉(zhuǎn)化子鑒定.挑取在復(fù)篩平板上生長的擬轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行種子液培養(yǎng)，以未轉(zhuǎn)化齒毛菌為對(duì)照.收集二級(jí)種子液菌絲，采用OMEGA試劑盒提取基因組DNA.以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Hyg和GFP基因，擴(kuò)增片段大小分別為1 026 bp和750 bp.Hyg基因上游引物Hyg-F： CTATTTCTTTGCCCTCGGAC，Hyg基因下游引物Hyg-R： ATGAAAAAGCCTGAACTCACC；GFP基因上游引物GFP-F： GATCTGACTAGTAAAGGAGAAGAAC，GFP基因下游引物GFP-R： TCACACGTGGTGGTGGTGGT.引物由上海Invitrogen有限公司合成.反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變形5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 原生質(zhì)體制備及再生

2.1.1 菌齡對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響

不同菌齡的菌絲，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成有所不同，對(duì)酶的敏感程度也不同，故原生質(zhì)體制備時(shí)形成數(shù)目也不同.幼嫩菌絲的細(xì)胞壁易被酶解形成原生質(zhì)體，但并非菌絲越幼嫩越利于酶解[12].選取不同菌齡的菌絲制備原生質(zhì)體，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率如圖1所示.由圖1結(jié)果可知，隨著菌齡增大，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率也隨之增加，48 h菌齡的原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率最高； 隨著菌齡繼續(xù)增大，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率迅速下降.因此該齒毛菌原生質(zhì)體形成及再生的最佳菌齡為48 h.盧明峰等[14]制備絲狀真菌AL18原生質(zhì)體時(shí)的最佳菌齡亦為48 h，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

2.1.2 穩(wěn)滲劑對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響

真菌細(xì)胞壁被破壞后形成的原生質(zhì)體需懸浮于高濃度穩(wěn)滲劑中維持原生質(zhì)體細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓平衡.菌株種屬不同，所適應(yīng)的穩(wěn)滲劑種類亦不同.不同種類的穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)及再生率的影響如圖2所示.圖2結(jié)果表明，不同種類穩(wěn)滲劑對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率的影響明顯不同.其中，原生質(zhì)體制備數(shù)： 甘露醇>KCl>蔗糖； 再生率： 蔗糖>甘露醇>KCl.雖然以甘露醇做穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體的形成數(shù)最多，但再生率并不是最高.而蔗糖作穩(wěn)滲劑時(shí)盡管原生質(zhì)體形成數(shù)最少，但是其再生率卻最高.由此可知，以甘露醇作穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體的制備效果最佳； 以蔗糖作穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體的再生效果最佳.

圖1 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.1 Effect of different hypha on protoplast’s production and regeneration

圖2 不同穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.2 Effect of different osmoticum on protoplast’s production and regeneration

糖類、糖醇類、無機(jī)鹽類等多種穩(wěn)滲劑被用于真菌原生質(zhì)體制備.雖然一般認(rèn)為無機(jī)鹽類適用于絲狀真菌，糖類和糖醇類適用于酵母和高等植物，但是目前無法確切解釋某種化學(xué)試劑作為穩(wěn)滲劑適用于某一特定菌株[9].孫墨可等[15]的研究表明在靈芝(Ganodermalingzhi)原生質(zhì)體制備時(shí)，以0.4 mol·L-1甘露醇作穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最高.盧明峰等[14]在絲狀真菌AL18原生質(zhì)體制備及再生的研究中發(fā)現(xiàn)，以0.6 mol·L-1MgSO4·7H2O作為穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體形成數(shù)最佳，而以0.6 mol·L-1蔗糖作穩(wěn)滲劑原生質(zhì)體再生效果最好.表明原生質(zhì)體制備及再生的最適穩(wěn)滲劑種類不一定一致，這與本研究結(jié)果相同.蔗糖作為穩(wěn)滲劑利于原生質(zhì)體的再生，可能是它不單維持滲透壓平衡，還可為原生質(zhì)體再生提供碳源.

2.1.3 溶壁酶質(zhì)量濃度對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響

真菌細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)及脂類等組成[16].溶壁酶可破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，釋放原生質(zhì)體.適當(dāng)?shù)娜鼙诿纲|(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體形成具有重要影響.溶壁酶質(zhì)量濃度過高，會(huì)破壞原生質(zhì)體細(xì)胞膜，從而影響原生質(zhì)體再生； 溶壁酶質(zhì)量濃度太低，原生質(zhì)體形成數(shù)少，原生質(zhì)體再生率低[5].不同質(zhì)量濃度溶壁酶對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率的影響如圖3所示.由圖3可知，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率都隨溶壁酶質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢.溶壁酶質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1時(shí)原生質(zhì)體形成數(shù)最多，再生率也最高，故原生質(zhì)體制備及再生的最佳溶壁酶質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1.陳鵬等[17]研究表明用20 mg·mL-1溶壁酶制備金針菇(Flammulinavelutipes)原生質(zhì)體的形成數(shù)最多，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

2.1.4 酶解溫度對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響

酶解溫度直接影響酶促反應(yīng)速率.不同菌株具有不同的最適酶解溫度，過高或過低都會(huì)影響酶活性，亦會(huì)影響原生質(zhì)體形成及再生.不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率的影響如圖4所示.由圖4可知，隨酶解溫度的升高，原生質(zhì)體制備數(shù)和再生率也隨之上升，當(dāng)酶解溫度到達(dá)30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體制備數(shù)和再生率達(dá)最高.隨酶解溫度的繼續(xù)升高，原生質(zhì)體制備數(shù)和再生率銳減.故齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的最佳酶解溫度為30 ℃.

圖3 不同溶壁酶質(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.3 Effect of different lywallzyme mass concentration on protoplast’s production and regeneration

圖4 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis temperature on protoplast’s production and regeneration

邢振楠等[18]用溶壁酶裂解香菇(Lentinulaedodes)菌絲，酶解溫度為30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體制備及再生效果最佳.陳鵬等[17]利用溶壁酶制備金針菇(Flammulinavelutipes)原生質(zhì)體，酶解溫度為26 ℃時(shí)，原生質(zhì)體制備率最高.因此溶壁酶作用于不同菌株，其最適酶解溫度亦有所不同.

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體制備及再生的影響

適當(dāng)?shù)拿附鈺r(shí)間也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素之一.酶解時(shí)間過短，細(xì)胞壁裂解不完全； 時(shí)間過長，細(xì)胞膜受損傷，原生質(zhì)體破裂[19].不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率的影響如圖5所示.由圖5可知，隨酶解時(shí)間的逐漸增加，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率亦逐漸升高.當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí)，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率最高； 之后隨酶解時(shí)間的延長，原生質(zhì)體形成數(shù)和再生率都明顯下降.因此，3 h為原生質(zhì)體制備及再生的最佳酶解時(shí)間.

陳鵬等[17]研究表明，金針菇(Flammulinavelutipes)以20 mg·mL-1溶壁酶酶解4 h，原生質(zhì)體制備率最高.盧月霞等[20]利用溶壁酶制備雞腿菇(Coprinuscomotus)原生質(zhì)體，酶解時(shí)間為3 h時(shí)，原生質(zhì)體形成數(shù)最多.可見，不同菌株原生質(zhì)體制備的最適酶解時(shí)長不同.

2.1.6 再生培養(yǎng)基對(duì)齒毛菌再生的影響

本實(shí)驗(yàn)以甘露醇為穩(wěn)滲劑制備原生質(zhì)體，以蔗糖為穩(wěn)滲劑配制1、2、3號(hào)3種再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)，結(jié)果如圖6所示.圖6結(jié)果表明在2號(hào)再生培養(yǎng)基中原生質(zhì)體再生率最高，3號(hào)再生培養(yǎng)基次之，1號(hào)再生培養(yǎng)基再生率最低.可能是2號(hào)再生培養(yǎng)基富含碳源氮源及微量元素，有利于齒毛菌的再生.

圖5 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis duration on protoplast’s production and regeneration

圖6 不同再生培養(yǎng)基對(duì)再生的影響Fig.6 Effect of different regeneration medium on protoplast’s production and regeneration

2.2 齒毛菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

2.2.1 潮霉素B敏感性測試

真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系中，以抗生素抗性做篩選標(biāo)記時(shí)，受體菌株對(duì)抗生素的敏感性十分重要.潮霉素B對(duì)大多數(shù)真菌都有較強(qiáng)的抑制作用，因此真菌遺傳轉(zhuǎn)化過程中常選擇攜帶潮霉素B抗性基因的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選擇合適的潮霉素B質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩和復(fù)篩.不同菌株對(duì)潮霉素B的敏感性不同.孫墨可等[15]研究表明，靈芝(Ganodermalingzhi)的潮霉素B最小受抑制質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1； 李剛等[21]研究表明赤靈芝(Ganodermalucidum)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，菌絲受100 μg·mL-1潮霉素B的抑制； Stephan 等[22]篩選雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)轉(zhuǎn)化子時(shí)的潮霉素B質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1.

實(shí)驗(yàn)中，齒毛菌菌絲在潮霉素B質(zhì)量濃度為10、20 μg·mL-1的PDA平板上生長緩慢，在潮霉素B質(zhì)量濃度為30 μg·mL-1的PDA平板上生長極緩慢，在潮霉素B質(zhì)量濃度為40、50 μg·mL-1的PDA平板上生長完全受抑制.因此，確定齒毛菌菌絲生長最小受抑制潮霉素B質(zhì)量濃度為40 μ·mL-1，本實(shí)驗(yàn)選用齒毛菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的篩選抗性為40 μg·mL-1潮霉素B.

2.2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

PEG介導(dǎo)質(zhì)粒pCAMBIA1302轉(zhuǎn)化齒毛菌原生質(zhì)體后，涂布于含40 μg·mL-1潮霉素B的2號(hào)再生平板上，30 ℃暗箱培養(yǎng)7 d再生出菌落.挑取再生單菌落至含40 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上，以未轉(zhuǎn)化的齒毛菌為對(duì)照.轉(zhuǎn)化子因攜帶有潮霉素B抗性基因，能夠在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上正常生長，而未轉(zhuǎn)化菌株無法生長.挑取在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上生長良好的菌株，轉(zhuǎn)接至含50 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上進(jìn)行復(fù)篩.

2.2.3 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

挑取復(fù)篩平板上生長良好的菌株在抗性平板上劃線擴(kuò)大培養(yǎng)，收集二級(jí)種子液菌絲提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增Hyg和GFP基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子.陽性轉(zhuǎn)化子攜帶Hyg和GFP基因，陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化菌株)無Hyg和GFP基因.從40個(gè)擬轉(zhuǎn)化子中最終驗(yàn)證獲得兩個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖7所示.1號(hào)和2號(hào)轉(zhuǎn)化子均出現(xiàn)1 026 bp大小的Hyg基因條帶和750 bp大小的GFP基因條帶，與質(zhì)粒pCAMBIA1302陽性對(duì)照條帶大小一致，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，表明質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入齒毛菌中.

Jiang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的遺傳轉(zhuǎn)化中，以潮霉素為抗性標(biāo)記時(shí)，未轉(zhuǎn)化菌株出現(xiàn)了較高的耐藥性，這可能與其分泌的漆酶相關(guān).漆酶能夠降解多種化合物，對(duì)多種抗生素也具有降解作用[24].本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化子鑒定時(shí)假陽性率較高，可能與齒毛菌高效分泌漆酶，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥性有關(guān).也可能是由于菌絲簇的存在，使未轉(zhuǎn)化菌株對(duì)潮霉素的耐受性提升，故在抗性平板上生長.

2.2.4 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性檢測

陽性轉(zhuǎn)化子，在無抗性PDA平板連續(xù)傳代5次，一次時(shí)長為5 d，最后轉(zhuǎn)接到含50 μg·mL-1潮霉素B抗性的PDA平板培養(yǎng)基上點(diǎn)種培養(yǎng)4 d，結(jié)果如圖8所示.1號(hào)和2號(hào)陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過5次傳代后，在含50 μg·mL-1潮霉素B抗性培養(yǎng)基上生長良好，而未轉(zhuǎn)化的HYB07菌株則不能生長，由此可知轉(zhuǎn)化子對(duì)潮霉素B仍具有抗性.通過此方法驗(yàn)證表明潮霉素B基因隨機(jī)插入突變體在有絲分裂過程中穩(wěn)定遺傳.

圖8 陽性轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性Fig.8 Genetic stability of positive transformants

孫墨可等[15]利用PEG成功對(duì)靈芝(Ganodermalingzhi)原生質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化率為每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化3～4個(gè)轉(zhuǎn)化子； 李剛等[21]通過PEG介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)入赤靈芝(Ganodermalucidum)原生質(zhì)體中，其轉(zhuǎn)化效率為每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化5～6個(gè)轉(zhuǎn)化子； Chou等[6]利用PEG介導(dǎo)重傘靈芝(Ganodermamultipileum)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率僅為每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化0.1個(gè)轉(zhuǎn)化子.可見多孔菌科真菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率較低，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率可能與菌體種特異性相關(guān).另有研究表明，裂褶菌屬(Schizophyllumcommune)富含AT的區(qū)域可能影響轉(zhuǎn)化子獲得潮霉素B抗性基因[25]； 灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinerea)中N末端的兩個(gè)氨基酸殘基可能抑制潮霉素B基因的表達(dá)[26].可見種屬特異性使獲得潮霉素抗性基因的難易程度也不同.因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，還需要對(duì)齒毛菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的條件做進(jìn)一步優(yōu)化，從而降低假陽性比率，提升轉(zhuǎn)化效率.

3 結(jié)語

齒毛菌以0.6 mol·L-1甘露醇為穩(wěn)滲劑，20 mg·mL-1溶壁酶于30 ℃酶解2 d菌齡的菌絲3 h，其原生質(zhì)體形成數(shù)可達(dá)1×108個(gè)·mL-1.以甘露醇為穩(wěn)滲劑，最優(yōu)條件下制備的原生質(zhì)體，在以蔗糖為穩(wěn)滲劑的2號(hào)再生培養(yǎng)基中再生率最高，為0.1%.利用PEG介導(dǎo)齒毛菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，在40 μg·mL-1潮霉素B抗性平板上成功篩選到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，成功建立了齒毛菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系.該遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立可為齒毛菌的基因改造、漆酶生產(chǎn)調(diào)控機(jī)制、次生代謝藥物合成機(jī)理等研究提供技術(shù)支持.