馬祖兵， 李小芳， 謝 龍， 趙甜甜， 孫 強， 唐海龍

（成都中醫(yī)藥大學藥學院， 中藥材標準化教育部重點實驗室， 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地， 四川 成都611137）

藥對是方劑組成的基本要素， 能較好地詮釋中藥復方“合群妙用” 的特點， 是單味中藥與復方之間的橋梁， 構成了中藥復方的核心［1］。 大黃-肉桂藥對源自《醫(yī)學衷中參西錄》 中的秘紅丹， 對肝郁多怒、 胃郁氣逆致吐血、 衄血等癥有一定治療作用； 大黃配伍肉桂， 以肉桂辛熱之性制大黃之苦寒峻下之勢， 以大黃苦寒之性制肉桂辛熱燥烈之弊， 兩者配伍使用， 達到振脾陽、 通大便之功效［2］。 大黃素為大黃主要活性成分， 具有清除自由基、 抗癌等活性［3-4］； 桂皮醛為肉桂揮發(fā)油主要活性成分， 除具有傳統(tǒng)的解熱鎮(zhèn)痛作用外， 對腫瘤、 糖尿病等也有治療作用， 而且兩者配伍具有抗肝癌作用［5-6］。

然而， 大黃素難溶于水， 口服溶出速度慢， 導致其生物利用度低， 限制了相關制劑開發(fā)與臨床應用［7］。 自微乳是藥物分散于一定比例的乳化劑、助乳化劑和油相后形成的制劑， 口服后能在胃腸道中與體液混合， 自發(fā)分散成粒徑小于100 nm 的水包油型乳滴［8］， 能增加難溶性藥物溶解能力， 促進藥物淋巴轉運及膜滲透， 減少首過效應， 被廣泛應用于制劑研發(fā)中［9-10］。 本實驗以大黃素為模型藥物， 肉桂揮發(fā)油為油相， 制備大黃素-桂皮醛自微乳， 然后通過單純形網格法優(yōu)化處方， 以期增加大黃素溶解度， 為相關制劑開發(fā)奠定基礎， 同時為中藥揮發(fā)油應用于自微乳油相提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Aglient 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； Nicomp 380 ZLS 型激光粒度儀（美國PSS 公司）； 85-2 型恒溫磁力攪拌器（常州澳華儀器有限公司）； 80-1 型離心沉淀器（江蘇正基儀器有限公司）； FA224 型電子分析天平（萬分之一， 上海舜宇恒平科學儀器有限公司）； RC-3 型溶出度測定儀（山東博科科學儀器有限公司）； XW-80A 型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器有限公司）； Tecnai G2 型透射電子顯微鏡 （美國Fei公司）。

1.2 試藥 大黃素原料藥（西安小草生物植物科技有限責任公司， 批號 XC20161203， 含有量97%）； 大黃素對照品（成都曼思特生物科技有限公司， 批號MUST-16110712， 含有量99.48%）；肉桂油（廣西貴港市陳桂堂）； 桂皮醛對照品（中國食品藥品檢定研究院， 批號110710-201720， 含有量98.4%）； 中鏈甘油三酸酯（鐵嶺北亞藥用油有限公司）； 油酸乙酯（國藥集團化學試劑有限公司）； 二乙二醇單乙基醚（淮安市和元化工有限公司）； 聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、 蓖麻油聚氧乙烯醚EL40 均購自山東優(yōu)索化工科技有限公司； 吐溫80、 吐溫20、 油酸、 甘油、 乳化劑OP10、 聚乙二醇400、 1， 2-丙二醇均購自成都市科龍化工試劑廠。 乙腈、 磷酸均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 大黃素、 桂皮醛含有量測定

2.1.1 色譜條件［11］Capcell Pak C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B）， 梯度洗脫（0 ～16 min， 75% B；16 ～20 min， 70% B； 20 ～30 min， 50% B； 30 ～40 min， 40%B； 40 ～50 min， 35%B； 50 ～60 min，75%B）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長265 nm；柱溫30 ℃。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取桂皮醛、大黃素對照品13.6、 8.3 mg， 置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋， 分別配制成272、 166 μg／mL 貯備液， 各精密量取2 mL 混合， 甲醇定容于10 mL 量瓶中， 搖勻， 即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取自微乳適量，置于100 mL 量瓶中， 甲醇超聲破乳溶解并定容，搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.1.4 線性關系考察 分別取對照品溶液2.5、5、 10、 20、 30、 40、 50 μL， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。 以進樣量為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 得回歸方程分別為大黃素Y＝3.153 7X＋35.736（R2＝0.999 0）， 線性范圍83～1 660 ng； 桂皮醛Y＝3.734X＋3.672 6 （R2＝1）， 線性范圍136～2 720 ng。

2.2 溶解度考察 精密稱取油相（油酸、 油酸乙酯、 中鏈甘油三酸酯、 肉桂油）、 乳化劑（RH40、吐溫80、 吐溫20、 OP10、 EL40）、 助乳化劑（1，2-丙二醇、 聚乙二醇400、 二乙二醇單乙基醚、 丙三醇） 各4 g 于西林瓶中， 加入過量大黃素， 超聲2 h 助溶， 37 ℃恒溫水浴靜置24 h 后， 4 000 r／min離心30 min， 取上清液適量， 甲醇稀釋至一定倍數， 按“2.1” 項下方法測定， 結果見表1。 由表可知， 大黃素在各油相中的溶解度依次為肉桂油＞中鏈甘油三酸酯＞油酸乙酯＞油酸， 各乳化劑中的溶解度依次為RH40 ＞吐溫80＞OP10＞EL40＞吐溫20， 各助乳化劑中的溶解度依次為PEG-400＞1， 2-丙二醇＞甘油＞二乙二醇單乙基醚。

表1 大黃素溶解度測定結果（±s， n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of emodin（±s， n＝3）

表1 大黃素溶解度測定結果（±s， n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of emodin（±s， n＝3）

組成 輔料 溶解度／（mg·mL-1）油相 油酸 0.570±0.032油酸乙酯 1.924±0.072中鏈甘油三酸酯 2.590±0.054肉桂油 7.583±0.102乳化劑 RH40 0.792±0.062吐溫80 0.612±0.045吐溫20 —OP10 0.571±0.059 EL40 0.220±0.043助乳化劑 1，2-丙二醇 13.124±0.289聚乙二醇400 15.610±0.187二乙二醇單乙基醚 10.830±0.153丙三醇 11.824±0.165

2.3 處方優(yōu)化

2.3.1 油相、 乳化劑篩選 選擇肉桂油、 油酸乙酯、 中鏈甘油三酸酯、 油酸（油相）， 以及RH40、EL40、 吐溫80、 吐溫20、 OP10 （乳化劑） 進行考察， 將兩者分別以1 ∶9、 2 ∶8、 3 ∶7、 4 ∶6 的比例加入西林瓶中旋渦振蕩5 min 混合均勻， 稱取0.1 g， 加37 ℃水稀釋100 倍， 300 r／min 恒速磁力攪拌， 觀察乳化情況， 并按目測評分標準［12］進行評價。結果， 肉桂油與RH40、 吐溫80 按照1 ∶9、2 ∶8、 3 ∶7 比例配伍稀釋后， 均形成澄清透明的乳化液， 而與吐溫20、 EL40、 OP10 按各比例配伍稀釋后均難以乳化， 形成白色絮狀物； 油酸乙酯、油酸與各乳化劑按各比例配伍稀釋后均難以乳化，導致液面有油層附著； 中鏈甘油三酸酯與RH40 按1 ∶9、 2 ∶8 比例配伍稀釋后， 均形成澄清透明的乳化液。 結合表1 結果， 初步確定肉桂油、 中鏈甘油三酸酯作為油相， RH40、 吐溫80 作為乳化劑。

2.3.2 助乳化劑篩選 將RH40、 吐溫80 與各助乳化劑按1 ∶1 比例混合， 再將混合物與油相按4 ∶1比例混合， 旋渦振蕩5 min 混合均勻， 稱取0.1 g， 加37 ℃水稀釋100 倍， 300 r／min 恒速磁力攪拌， 觀察乳化時間。結果， 以1， 2-丙二醇為助乳化劑時， 肉桂油-RH40、 肉桂油-吐溫80 組合乳化時間均優(yōu)于其他助乳化劑與油相-乳化劑組合，故確定肉桂油作為油相， 1， 2-丙二醇作為助乳化劑， 同時因RH40、 吐溫80 乳化效果接近， 故考慮將兩者按一定比例混合作為乳化劑。

2.3.3 乳化劑比例篩選 將RH40 與吐溫80 分別按10 ∶0、 9 ∶1、 8 ∶2、 7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5、 4 ∶6、 3 ∶7、 2 ∶8、 1 ∶9、 0 ∶10 比例混合， 助乳化劑-混合乳化劑-油相以4 ∶4 ∶2 比例制備空白自微乳。 稱取空白自微乳0.1 g， 加37 ℃水稀釋100倍， 300 r／min 恒速磁力攪拌， 激光粒徑儀測定空白自微乳液平均粒徑和多分散指數（PDI）， 結果見圖2。 由圖可知， 混合乳化劑的乳化效果優(yōu)于單一乳化劑， 而且當RH40 與吐溫80 比例為6 ∶4 時作用最優(yōu)。

圖2 乳化劑比例對粒徑和PDI 的影響Fig.2 Effects of emulsifier ratio on particle size and PDI

2.3.4 偽三元相圖繪制 將RH40、 吐溫80、RH40-吐溫80 （6 ∶4） 與1， 2-丙二醇分別按9 ∶1、 8 ∶2、 7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5、 4 ∶6、 3 ∶7、 2 ∶8、1 ∶9 比例混合， 再與肉桂油分別按9 ∶1、 8 ∶2、7 ∶3、 6 ∶4、 5 ∶5 比例旋渦振蕩5 min 混合均勻，制備空白自微乳， 加 37 ℃水稀釋 100 倍，300 r／min恒速磁力攪拌， 記錄各相形成微乳的比例， 通過Origin 8.5 軟件繪制油相-乳化劑-助乳化劑偽三元相圖， 結果見圖3。 由圖可知， 混合乳化劑形成的微乳面積大于單一乳化劑， 由陰影面積區(qū)可得肉桂油、 RH40-吐溫80 （6 ∶4）、 1， 2-丙二醇比例分別為10% ～40%、 10% ～85%、 10% ～75%。

圖3 RH40、 吐溫80 偽三元相圖Fig.3 Pseudo-ternary phase diagrams for RH40 and Tween80

2.4 單純形網格法優(yōu)化 將肉桂油、 RH40-吐溫80 （6 ∶4）、 1， 2 丙二醇的總量定為100%， 根據偽三元相圖結合各相實際配伍特點， 確定各相質量比例范圍分別為肉桂油10% ～40%、 RH40-吐溫80（6 ∶4） 30% ～60%、 1， 2-丙二醇30% ～60%， 將以上三相按單純形網格法試驗設計比例加入西林瓶中， 旋渦振蕩5 min 混合均勻， 加入過量大黃素混合均勻， 超聲助溶2 h 后于37 ℃水浴靜置24 h 以達到溶解平衡， 取上清液， 即得載藥自微乳。 取自微乳0.5 g， 加入37 ℃水稀釋100 倍， 磁力攪拌至完全乳化， 激光粒徑儀測定自微乳平均粒徑和PDI； 再精密稱取自微乳0.1 g 于10 mL 量瓶中，37 ℃水定容振蕩， 使其形成乳化液， 4 000 r／min離心30 min， 移取上清液適量， 甲醇稀釋至一定倍數， 按“2.1” 項下方法測定載藥量， 以肉桂油（A）、 RH40-吐溫80 （6 ∶4） （B）、 1， 2 丙二醇（C） 用量為影響因素， 平均粒徑 （Y1）、 PDI（Y2）、 大黃素載藥量（Y3） 為評價指標優(yōu)化處方，結果見表2。

表2 試驗設計及結果Tab.2 Design and results of tests

通過Design Expert 8.06 軟件進行擬合， 得到回歸方程分別為Y1＝-13.489 09A-3.481 44B-5.747 53C＋0.526 8AB＋0.775 35AC＋0.191 03BC-0.019 968ABC （R2＝0.999 7，＝0.999 5）、Y2＝0.039 249A＋0.012 406B＋0.024 99C-1.367 63×10-3AB-1.628 79×10-3AC-8.509 13×10-4BC ＋5.706 85×10-5ABC （R2＝0.984 1，＝0.970 5）、Y3＝-2.451 03A-0.584 32B-0.717 94C＋0.091 511 AB＋0.070 170AC＋0.035 233BC-2.240 74×10-3ABC（R2＝0.997 3，＝0.994 9）， 上述方程P 均＜0.000 1， 模型水平非常顯著； 失擬項P 均＞0.05，相對于純誤差水平不顯著； R2、均＞0.95， 表明模型擬合度較好， 具有代表性， 能客觀準確地根據自變量變化情況進行預測［12］。 響應面分析見圖4。

圖4 各因素響應面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

參考文獻［13］， 以大黃素載藥量越大， 粒徑、 PDI 越小為優(yōu)化指標， 通過Design Expert 8.0.6 軟件預測最佳油相-乳化劑-助乳化劑比例，確定最優(yōu)處方為肉桂油用量10%， RH40-吐溫80（6 ∶4） 用量60%， 1， 2-丙二醇用量30%。 然后，根據上述最優(yōu)處方制備3 份自微乳進行驗證試驗，結果見表3， 可知實際值與預測值相當， 所建模型預測性良好。

表3 顯示， 最優(yōu)處方對大黃素的飽和載藥量為17.73 mg／g， 但大黃素加入量過大時， 加水稀釋形成微乳后靜置一段時間會有藥物結晶析出， 使其粒徑和PDI 變大， 其原因可能是載藥量過大時大黃素結晶析出， 自微乳體系難以形成穩(wěn)定的界面膜，從而影響平均粒徑和PDI［13］， 故考慮適當減少原料藥加入。 最終確定， 自微乳制備方法為精密稱取肉桂油2.0 g、 RH40-吐溫80 （6 ∶4） 12.0 g、 1，2-丙二醇6.0 g， 置于50 mL 燒杯中， 37 ℃水浴下300 r／min 恒速磁力攪拌10 min 混合均勻， 加入0.35 g 大黃素， 磁力攪拌15 min 后超聲助溶1 h，即得。

表3 驗證試驗結果（n＝3）Tab.3 Results of verification tests （n＝3）

2.5 體外評價

2.5.1 外觀 在低溫（4 ℃） 下， 自微乳較黏稠，不透明， 并呈深紅色； 在室溫（25 ℃） 下， 自微乳流動性較好， 澄清透明。 將自微乳濃縮液用蒸餾水稀釋100 倍后， 可得澄清透明的黃色溶液。

2.5.2 形態(tài) 取自微乳適量， 加入37 ℃蒸餾水稀釋100 倍， 取適量滴加到200 目銅網表面， 濾紙吸取多余液體， 2%磷鎢酸溶液負染色2 min， 濾紙吸取多余液體， 自然晾干， 在透射電鏡（TEM） 下觀察， 結果見圖5。 由圖可知， 自微乳經蒸餾水稀釋后呈圓球形， 大小均勻， 乳滴之間無粘連， 粒徑大小在30 nm 以下。

圖5 自微乳TEM 圖Fig.5 TEM images for self-microemulsions

2.5.3 粒徑、 PDI、 Zeta 電位 自微乳加水稀釋100 倍后， 測得平均粒徑為 （17.5±0.41） nm，PDI 為0.083±0.02， Zeta 電位為（-12.71±0.06）mV， 表明所得自微乳粒徑較小， 分布較窄， 體系較穩(wěn)定。

2.5.4 載藥量 精密稱取自微乳0.1 g （M1）， 置于10 mL 量瓶中， 37 ℃水定容， 振蕩使其形成乳化液， 4 000 r／min 離心30 min， 移取上清液適量，甲醇稀釋至一定倍數， 按“2.1” 項下方法測定含有量， 計算載藥量（M2／M1）， 測得大黃素、 桂皮醛載藥量分別為（16.66±0.29）、 （91.36±0.48）mg／g。

2.5.5 溶出度［7］精密稱取含大黃素50.0 mg 的原料藥和自微乳， 裝于膠囊殼中， 根據2015 年版《中國藥典》 溶出度測定法第二法（籃法） 測定，以900 mL 水為溶出介質， 設定轉速100 r／min， 溫度（37.0±0.5）℃， 分別于3、 6、 9、 15、 20、 30、40、 50、 60、 90、 120 min 取樣， 每次2 mL， 同時補足等溫等體積溶出介質， 溶液經0.45 μm 微孔濾膜濾過， 按“2.1” 項下方法測定大黃素含有量， 繪制溶出曲線， 見圖6。 由圖可知， 大黃素原料藥在120 min 內累積溶出度小于10%， 而自微乳中其累積溶出度在20 min 已達96.87%， 表明自微乳可有效提高大黃素在水中的溶出速率。

圖6 大黃素溶出曲線Fig.6 Dissolution curves for emodin

3 討論

本實驗發(fā)現， 大黃素在肉桂油中的溶解度較大， 為肉桂油作為大黃素-桂皮醛自微乳油相提供了可能性， 而且肉桂油主要成分桂皮醛相當分子質量較小， 僅為132.15， 有報道［14］小分子油相能較容易地嵌入到表面活性劑中， 與乳化劑形成界面膜， 增溶能力好于大分子油相。 油相與乳化劑的配伍結果表明， RH40 和吐溫80 對肉桂油的乳化效果均較好， 其中前者具有抑制P-糖蛋白對藥物外排或抑制腸細胞色素P450 對藥物催化的作用， 故還能增加藥物的膜滲透性［15］， 但它在常溫下為凝固態(tài)， 使用不方便， 故考慮將其與后者按照6 ∶4的比例混合作為乳化劑。 通過考察混合乳化劑對自微乳粒徑和PDI 的影響， 同時比較混合乳化劑和單一乳化劑自微乳面積區(qū)域大小， 可較全面地證明混合乳化劑乳化效果優(yōu)于單一乳化劑， 其原因可能是混合乳化劑可有效改善單一乳化劑用量多、 乳化時間長等缺點， 從而提高體系穩(wěn)定性、 載藥量等［16］。

然后， 本實驗采用單純形網格法優(yōu)化大黃素-桂皮醛自微乳處方， 相較于目前廣泛應用的正交試驗及星點設計-效應面法［17-18］， 該方法具有試驗次數少、 預測準確的優(yōu)點， 能客觀明確地分析非線性條件下總量恒定、 相互影響的油相-乳化劑-助乳化劑與指標之間的關系［19］。 考慮到載藥量過大時會引起藥物析出， 從而影響自微乳平均粒徑和PDI，故適當減少大黃素加入量， 最終制得平均粒徑較小、 分布較窄、 體系較穩(wěn)定的自微乳， 并可顯著改善難溶性成分大黃素的溶解度。

“藥輔合一” 思想是中藥制劑輔料選擇的重要原則， 也是不同于西藥制劑的顯著特征， 在中藥制劑中具有普遍性［20］。 本實驗將大黃-肉桂藥對中的肉桂油既作為自微乳中的油相又作為藥物， 體現了該思想， 同時為自微乳在含有揮發(fā)油、 難溶性成分中藥藥對中的應用提供了新思路。 今后， 將重點研究大黃其他成分與肉桂有效成分配伍制備自微乳，并將桂皮醛載藥量作為處方優(yōu)化的評價指標。