吳 姍，李 可，方 云，樓成杰，虞惠貞，張明哲，帥江冰，張曉峰

（浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州310016）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡稱單增李斯特菌）和致病性弧菌是生活中常見的、危害性較大的食源性致病菌。人感染單增李斯特菌往往是通過攝入被污染的食品如牛奶、奶酪、肉類和海鮮等引起的[1]。新生兒、孕婦及其他40歲以上的成人、免疫功能缺陷者都是易感人群。感染單增李斯特菌后的癥狀可表現(xiàn)為突然發(fā)熱、劇烈頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等。自20世紀(jì)90年代以來，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）將單增李斯特菌列為4大食源性疾病的致病菌之一。霍亂弧菌、副溶血弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、梅氏弧菌等都是重要的致病性弧菌，可引起食物中毒，使患者出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致敗血癥，甚至死亡。其中霍亂弧菌中的O1群和O139群菌株可以引起嚴(yán)重的腹瀉，致死率較高，被《中華人民共和國傳染病防治法》列為甲類傳染病。

在醫(yī)學(xué)診斷及食品微生物檢測中，除了通常使用的培養(yǎng)方法（如ISO 11290-1—2017，ISO 11290-1—1996，ISO 11290-2—1998和ISO 11290-1 AMD 1—2004）外，還開發(fā)了一系列的生物化學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等[1-4]，如20世紀(jì)90年代以后，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，國外推出了一些基于檢測生理代謝的細(xì)菌自動化鑒定系統(tǒng)（如API、Biolog、Vitek等）及基于免疫學(xué)的酶標(biāo)抗體法（ELISA）、熒光抗體染色法（免疫熒光法）、同位素標(biāo)記抗體法（放射免疫）等。盡管這些方法具有操作簡便、快速的特點，但也存在特異性較差、所需的耗材價格昂貴等缺點，目前很少在國內(nèi)推廣。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法主要集中在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)的應(yīng)用上。PCR是一種體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)，可在短時間內(nèi)將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍。該技術(shù)具有簡便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點，是目前國內(nèi)外快速檢測技術(shù)研究的重點。但PCR方法在不同的實驗室或檢測部門所檢測的目的基因和操作流程上有一定的差異，沒有形成標(biāo)準(zhǔn)，得到的檢測結(jié)果也不盡相同。近年來的實踐應(yīng)用還表明，食品和培養(yǎng)基中存在的抑制劑可影響PCR反應(yīng)，使檢測結(jié)果呈假陰性。盡管人們對PCR方法進(jìn)行了不斷的改進(jìn)和完善，卻不能有效地阻止假陰性結(jié)果的發(fā)生。熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization,FISH）是基于微生物細(xì)胞中16S或23S rRNA的高拷貝數(shù)和不易受環(huán)境影響的穩(wěn)定性檢測樣品中的微生物的方法[5-6]。如SCHMID等[7]使用DNA探針結(jié)合FISH技術(shù)檢測了李斯特菌屬。肽核酸探針（peptide nucleic acid,PNA）是一種DNA的模擬物，將PNA探針和FISH技術(shù)結(jié)合可以克服DNA探針細(xì)胞穿透性差、雜交親和力不強(qiáng)等弱點[5,8]。PNA-FISH現(xiàn)已被用于大腸埃希菌[9]、鏈球菌[10]、坂歧腸桿菌[11]、白念珠菌[12]等細(xì)菌和真菌的檢測。上述檢測都只涉及用單重?zé)晒鈽?biāo)記探針進(jìn)行檢測。為了提高檢測通量，MALIC等[13]成功地使用3個分別標(biāo)記3種不同熒光的PNA探針同時檢測人類皮膚傷口上的3種細(xì)菌；ALMEIDA等[14]則使用多重?zé)晒鈾z測技術(shù)同步檢測了李斯特菌、沙門菌和大腸埃希菌。但上述的多重?zé)晒鈾z測對設(shè)備的要求較高，樣本都需要在激光共聚焦顯微鏡下觀察。而相比于普通熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的普及率仍較低。因此，本研究擬嘗試用普通熒光顯微鏡實現(xiàn)雙重PNA-FISH檢測。ZHANG等[15-16]報道了用PNA-FISH方法分別檢測單增李斯特菌和弧菌的技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，本研究采用雙色熒光分別標(biāo)記單增李斯特菌和弧菌特異性的PNA探針，以實現(xiàn)用普通熒光顯微鏡同步檢測單增李斯特菌和主要致病性弧菌的目的。

1 材料與方法

1.1 PNA探針

在本研究中所使用的PNA探針如表1所示，Lm-16S-2[15]為單增李斯特菌特異性探針，Vib-16S-1[16]為致病性弧菌特異性探針，BacUin[17]為細(xì)菌通用探針。所有探針由Panagene公司（韓國）合成。由于所使用的探針Lm-16S-2和Vib-16S-1均來自文獻(xiàn)[15-16]，因此本研究不再對探針的特異性和靈敏度進(jìn)行驗證。

1.2 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

在本研究中所使用的菌株見表2。由于本文的重點是研究使用普通熒光顯微鏡建立雙重?zé)晒釶NA探針同步檢測單增李斯特菌和致病性弧菌的方法，因此只選擇了目標(biāo)細(xì)菌菌株進(jìn)行方法的優(yōu)化，而未選擇非目標(biāo)菌株對探針的特異性進(jìn)行驗證。

表1 PNA探針序列Table1 PNAprobe sequences used in this study

表2 所使用的菌株Table2 Strains used in this study

單增李斯特菌菌株用腦心浸出液（brain heart infusion,BHI）培養(yǎng)基培養(yǎng)，弧菌用3%氯化鈉堿性蛋白胨水（3%NaCl alkaline peptone water,APW）培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述細(xì)菌在30℃、130 r/min條件下振蕩過夜，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.3 PNA-FISH操作步驟

離心（2 000 g，5 min）收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS）（pH 7.4）洗滌1次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至D（600 nm）=1.0～1.2，取10μL菌液（應(yīng)用雙重?zé)晒馔瑫r檢測2種菌時，2種菌各取5μL）于用98%乙醇清洗過的玻片（1 cm×1 cm）上，涂勻，火焰固定，將玻片于80%乙醇中浸泡15 min，風(fēng)干；取25μL含500 pmol/mL PNA的雜交緩沖液（pH 7.5，10%硫酸葡聚糖，10 mmol/L NaCl，30%甲酰胺，0.1%焦磷酸鈉，0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0.2%聚蔗糖，5 mmol/L Na2EDTA，0.2%TritonX-100，50 mmol/L Tris/HCl）滴加于玻片上（雙重?zé)晒鈾z測時，2種探針各加入12.5μL），55℃作用30 min，雜交后將玻片于55℃預(yù)熱的洗滌緩沖液（pH 10，5 mmol/L Tris，15 mmol/L NaCl，0.1%TritonX-100）中洗滌2次，每次10 min，將風(fēng)干后的涂片滴上香柏油，同時進(jìn)行陽性對照和陰性對照實驗，以BacUin作為陽性對照探針，以不加任何探針的涂片作為陰性對照；在熒光顯微鏡（Leica DM 6000B）的100倍物鏡（滴加香柏油）下觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。

1.4 2種菌液的比例對雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響

將單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的菌液濃度調(diào)節(jié)至D（600 nm）=1.0～1.2，將檢測總量控制在10μL的情況下，按比例添加2種菌液，以此比較菌液比例對雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 雙重PNA雜交條件

在前期的研究中對單增李斯特菌和弧菌的PNA-FISH雜交程序進(jìn)行了優(yōu)化，且發(fā)現(xiàn)2種菌的最佳雜交條件相近（即1.3所述雜交條件）[15-16]，因此在進(jìn)行雙重?zé)晒馓结橂s交檢測時，我們在上述優(yōu)化檢測條件下，對2種目標(biāo)細(xì)菌濃度、相應(yīng)的探針濃度及雜交條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。應(yīng)用雙重?zé)晒馔瑫r檢測2種細(xì)菌時，2種細(xì)菌各取5μL，加入探針的量也變?yōu)?種探針各加入12.5μL，檢測結(jié)果如表3及圖1～4所示。當(dāng)2種細(xì)菌同時存在時，無論是加入1種探針（圖1～3）還是同時加入2種探針（圖4），都有較好的雜交結(jié)果。因此，上述檢測條件可以滿足2種細(xì)菌的同步雙重PNA探針雜交檢測。

表3 不同熒光標(biāo)記的PNA探針在不同檢測通道下對單增李斯特菌和弧菌的檢測結(jié)果Table3 Detection result of L.monocytogenes and Vibrio with different fluorescence-labeled PNAprobes at different detection channels

2.2 檢測通道的選擇

Lm-16S-2是用于檢測單增李斯特菌的PNA探針，用FAM熒光標(biāo)記，可被I3和L5濾光模塊檢測到綠色熒光；Vib-16S-1和BacUin分別是用于檢測弧菌和細(xì)菌的PNA探針，都是用Cy3作為熒光標(biāo)記，可被N21和Y3濾光模塊檢測到紅色熒光。比較這些濾光模塊可發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記FAM熒光的細(xì)菌可被I3和L5濾光模塊檢測到綠色熒光，且在相同視野下，I3通道檢測到的熒光亮度略高于L5；同樣，標(biāo)記Cy3熒光的細(xì)菌能被N21和Y3濾光模塊檢測到紅色熒光，同樣，在相同視野下，N21檢測到的熒光亮度略高于Y3模塊。如表3所示：L.m EGD與Lm-16S-2探針雜交時，I3的綠色熒光強(qiáng)度可達(dá)到“+++”，而L5只有“++”；與BacUin探針雜交時，N21的紅色熒光強(qiáng)度可達(dá)到“+++”，而Y3只有“++”。但同時也發(fā)現(xiàn)，只標(biāo)記綠色熒光的細(xì)菌，也會在紅色熒光檢測模塊下檢測到紅色熒光，如L.m EGD與Lm-16S-2探針雜交時，不僅能在I3、L5通道下檢測到綠色熒光，也在N21模塊下檢測到紅色熒光；同樣，只標(biāo)記紅色熒光的細(xì)菌，也會在綠色熒光檢測模塊下檢測到綠色熒光，如V.v Vul-wz2009與Vib-16S-1探針雜交時，不僅能在N21、Y3下檢測到紅色熒光，也能在I3及L5模塊下檢測到綠色熒光，但綠色熒光強(qiáng)度明顯弱于紅色熒光，且L5檢測到的綠光更弱于I3。這說明不同熒光檢測通道間存在一定的干擾，在單色熒光檢測時，該干擾可忽略，但在不同細(xì)菌的多色熒光多重標(biāo)記、多通道同時檢測時，則要考慮由該原因?qū)е碌募訇栃詥栴}。

圖1 單增李斯特菌L.m54002和副溶血性弧菌V.pATCC17802的混合菌體雜交了Lm-16S-2探針后，在不同檢測通道下觀察到的熒光圖像Fig.1 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with Lm-16S-2 probe under different filter cubes

圖2 單增李斯特菌L.m54002和副溶血性弧菌V.pATCC17802的混合菌體雜交了弧菌探針Vib-16S-1后，在不同檢測通道下觀察到的熒光圖像Fig.2 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with Vib-16S-1 probe under different filter cubes

圖3 單增李斯特菌L.m 54002和副溶血性弧菌V.p ATCC17802的混合菌體雜交了通用探針BacUin后，在不同檢測通道下觀察到的熒光圖像Fig.3 Fluorescence images from the hybridization results of L.m 54002 and V.p ATCC17802 with BacUin probe under different filter cubes

圖4 單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的混合菌體雜交了Lm-16S-2和Vib-16S-1探針后，在不同檢測通道下觀察到的熒光圖像Fig.4 Fluorescence images from the hybridization results of L.m SLCC2755 and V.c MM-43 with Lm-16S-2 and Vib-16S-1 probes under different filter cubes

在單重?zé)晒鈾z測時，檢測通道模塊I3和N21已經(jīng)能滿足檢測要求，但在多重?zé)晒鈾z測時，這2個通道間的交叉干擾會導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，因此引入L5和Y3檢測通道模塊。檢測結(jié)果顯示，L5和Y3較I3和N21產(chǎn)生的假陽性少，如L.m 54002+V.p ATCC17802與Lm-16S-2探針雜交（圖1）時，理論上只有綠色熒光通道上能檢測到綠色熒光，但N21通道也檢測到了紅光，相比較而言，Y3通道能成功屏蔽熒光的干擾，在該通道上未能檢測到假陽性的紅色熒光；同樣，L.m 54002+V.p ATCC17802與Vib-16S-1探針雜交（圖2）時，理論上只有在紅色熒光通道上能檢測到紅色熒光，但在I3通道上檢測到了較弱的綠光，而在L5通道上則未能檢測到假陽性的綠光。但L5和Y3模塊也未能杜絕相鄰熒光間的干擾，特別是用BacUin探針雜交（圖3）時，得到的熒光亮度都較強(qiáng)，因此，L5通道往往也能檢測到假陽性的綠色熒光。而在使用單增李斯特菌和弧菌的特異性PNA探針（分別標(biāo)記FAM和Cy3熒光）進(jìn)行雙重?zé)晒鈾z測時，L5和Y3檢測通道模塊是可行的。

圖4是單增李斯特菌和弧菌的混合菌液同時與2種目標(biāo)菌探針進(jìn)行雙重?zé)晒怆s交的結(jié)果，即單增李斯特菌L.m SLCC2755和霍亂弧菌V.c MM-43的混合菌體同時雜交探針Lm-16S-2和Vib-16S-1。結(jié)果表明：被探針Lm-16S-2雜交后的單增李斯特菌可在L5檢測通道上觀察到綠色熒光（圖4A）；被探針Vib-16S-1雜交后的霍亂弧菌可在Y3檢測通道上觀察到紅色熒光（圖4B）。

此外，本實驗的陰性對照均未被檢測到目標(biāo)菌的熒光圖像（圖略）。

2.3 2種菌液的體積比例對檢測結(jié)果的影響

上述檢測都是在2種菌液體積比接近1∶1的理想條件下進(jìn)行的，而在實際情況下，同步檢測時可能2種菌的含量會有差異。因此，在上述檢測條件不變的情況下，比較了2種菌液在不同體積比例下雙色探針同步雜交檢測的結(jié)果，如表4所示：在3∶7或7∶3的比例下，可同步雙通道檢測2種菌；當(dāng)比例為1∶9或9∶1時，量少的菌則明顯在視野中減少，亮度明顯減弱；當(dāng)比例為1∶19或19∶1時，量少的菌則在視野中很難被檢測到。

表4 L.mSLCC2755和V.c MM-43菌液體積比例對雙重PNA探針雜交結(jié)果的影響Table4 Effect of the volume ratio of L.m SLCC2755 and V.c MM-43 on the dual PNAprobe hybridization results

3 討論

我們將2種菌單獨雜交時的最優(yōu)化程序（2種優(yōu)化后雜交程序相似度高）直接用到雙重雜交上，結(jié)果顯示，若2種菌含量相似，則該優(yōu)化程序可直接應(yīng)用。但當(dāng)2種菌的含量差異較大時，量少的菌就會存在漏檢，原因在于：一是由于菌液在玻片上固定后，還要經(jīng)過乙醇浸泡的步驟，該步驟會使固定不牢的菌脫落而導(dǎo)致漏檢；二是量少的菌受到量大的菌的干擾，影響探針的雜交而導(dǎo)致漏檢。原本計劃通過雜交程序的優(yōu)化減少漏檢的可能，但在實際檢測中，某個樣本很少會同時感染單增李斯特菌和弧菌。但即便同時存在，在雙重檢測中，樣本分成兩部分同時進(jìn)行針對李斯特菌和弧菌的不同增菌處理，也可避免因某種菌菌量過低而導(dǎo)致的漏檢。

在單重?zé)晒鈾z測時，檢測通道I3和N21可完全滿足檢測的需求。但在多重?zé)晒馔瑫r檢測時，由于熒光通道間的干擾，會造成假陽性，因此我們引入了L5和Y3新的熒光檢測通道。L5（512～542 nm）和 Y3（575～645 nm）的濾光區(qū)間較 I3（450～490 nm）和N21（515～560 nm）的濾光區(qū)間間隔大些，因此可更有效地屏蔽一些熒光干擾。

SHEPARD等[18]研究表明，用普通熒光顯微鏡及雙色熒光標(biāo)記PNA探針，應(yīng)用PNA-FISH法可同步檢測白念珠菌（Candida albicans）和光滑念珠菌（Candida glabrata）。MORGAN等[19]研究表明，用普通熒光顯微鏡可對大腸埃希菌（Escherchia coli）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugionsa）進(jìn)行雙重?zé)晒鈾z測。但上述實驗并沒有說明用的是什么型號的熒光顯微鏡，只顯示所使用的熒光顯微鏡配有異硫氰酸熒光素/德克薩斯紅雙通帶濾鏡（fluorescence microscope equipped with a fluorescein isothiocyanate(FITC)/Texas Red(TXR)dual bandpass filter）。由此推測，他們所標(biāo)記的熒光應(yīng)該是FITC和TXR，但實際并沒有以這2種熒光的名字命名的濾光模塊，說明他們使用的可能只是能濾過這2種熒光的濾光模塊。而在結(jié)果及分析中也未提及這2種熒光間是否會存在干擾。我們發(fā)現(xiàn)，染料FITC（發(fā)射波長520 nm）和TXR（615 nm）的最大發(fā)射波長的差異較本研究選擇的FAM（522 nm）和Cy3（570 nm）大，這也有助于減少2種熒光間的干擾，在后續(xù)研究中，可嘗試用TXR替換Cy3。DELLA-LATTA等[20]使用Traffic Light PNA FISH試劑盒同步檢測了3種微生物，檢測結(jié)果以綠紅黃三色分別表示大腸埃希菌（E.coli）、銅綠假單胞菌（P.aerugionsa）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）?？赡苡捎谑褂玫氖窃噭┖?，因此DELLA-LATTA等[20]并未說明探針標(biāo)記的是什么熒光，只是說明檢測所使用的熒光顯微鏡配有異硫氰酸熒光素/德克薩斯紅雙通帶濾鏡。而在實際檢測中若各種菌的形態(tài)相近，則各種標(biāo)記熒光和熒光濾光模塊的選擇就非常重要，否則很容易由于熒光通道間的干擾造成假陽性。

總之，本實驗結(jié)果表明，普通熒光顯微鏡也可以用作多重PNA-FISH的檢測，但受熒光通道等的限制，三重檢測會較困難，但可以完成雙重?zé)晒鈾z測。