章喬艷，邵馮金，俞向前，譚 勛*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201200）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一類起源于骨髓的血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管修復(fù)和新生血管形成中發(fā)揮重要作用[1]，是目前心血管系統(tǒng)疾病領(lǐng)域[2]和組織再生領(lǐng)域[3]的研究熱點(diǎn)。由于EPCs可向受損血管定向遷移，因此，基于EPCs的細(xì)胞治療引起了學(xué)術(shù)界的極大興趣[4]。

CD133/prominin 1是一種跨膜糖蛋白，哺乳動(dòng)物的CD133分子由1個(gè)N端胞外域、5個(gè)跨膜區(qū)、2個(gè)大的胞外環(huán)、2個(gè)小的富含半胱氨酸的胞內(nèi)環(huán)及1個(gè)胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[5]。CD133被認(rèn)為是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面標(biāo)志分子[6]，與KDR（VEGRF-2）或CD31一道被廣泛用于鑒定EPCs[7-8]。

肉雞肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension,PAH）是發(fā)生于商品肉雞的一種主要的心血管疾病，以肺血管病理性重構(gòu)為特征，致死率極高，對(duì)世界肉雞業(yè)造成極大危害[9]。此外，PAH肉雞還被認(rèn)為是人PAH的良好動(dòng)物模型，得到了學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注[10-11]。因而，探討肉雞PAH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制一直是獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。我們最近的研究提示，EPCs功能障礙在PAH肉雞肺血管病變發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[12]，這從新的角度揭示了肉雞PAH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。然而，由于缺乏家禽特異性的商品化CD133抗體，對(duì)家禽EPCs的表型鑒定存在一定困難[13-14]。

本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用禽CD133蛋白N端胞外域重組蛋白免疫小鼠，制備了抗禽CD133多克隆抗體，為開(kāi)發(fā)禽CD133抗體提供了技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及試驗(yàn)動(dòng)物

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒、異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）和弗氏佐劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶和鎳離子柱-重力流（His60 Ni gravity columns）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；商品化鼠抗CD133購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；電致化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence,ECL）顯影液購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)（Bio-Rad）公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜購(gòu)自德國(guó)默克密理博（Merck Millipore）公司；9周齡成年雌性BALB/c小鼠購(gòu)自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 菌種和質(zhì)粒

pMD-19T和PET-28a（+）載體由浙江大學(xué)動(dòng)物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸埃希菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 CD133胞外區(qū)原核表達(dá)

1.3.1 胞外區(qū)預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)

通過(guò)TMHMM-2.0服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì) 禽 CD133（登錄 號(hào) ：NP_001278578.1）跨膜區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)合ExPASy工具中ProtScale親水性預(yù)測(cè)（Hphob./Hopp&Woods）結(jié)果，選擇N端去信號(hào)肽后的89個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的胞外域作為候選抗原，設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增其全長(zhǎng)編碼序列。帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物序列為5′-CGGGATCCGAAGTACAGCCTATATACAAGCCG C-3′，帶有XhoⅠ酶切位點(diǎn)的下游引物序列為5′-CCGCTCGAGCTCATAGTAGATGGCCTGGAGTG T-3′。CD133引物設(shè)計(jì)模板來(lái)源于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上發(fā)表的禽CD133序列（登錄號(hào)：NM_001291649）。

1.3.2 CD133胞外區(qū)基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增所用模板為肉雞肺組織cDNA（肺組織中含有豐富的EPCs）。割膠回收目的條帶，連接pMD-19T載體并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，涂布于含有100 μg/mL氨芐霉素的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h后，挑取陽(yáng)性單克隆送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，連接表達(dá)載體pET-28a（+），轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h后，挑取陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送樣測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的pET-28a-CD133質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），涂布于固體培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性克隆于含有50 μg/mL卡那霉素的LB/Km培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液吸光度值達(dá)0.8～1.0時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution,PBS）重懸，于冰上超聲破碎，直至菌液清澈透明，4℃、1×104r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀用與上清液相同體積的PBS重懸。取相同體積上清液和沉淀懸液與上樣緩沖液混合，95℃變性10 min，8 000 r/min離心10 min，取各自上清液在12%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。

大量培養(yǎng)細(xì)菌并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集菌體，并用含有8 mol/L脲的PBS重懸菌體，于冰上超聲破碎，4 ℃、1×104r/min離心30 min。取上清液，過(guò)鎳離子柱進(jìn)行蛋白純化。調(diào)整洗滌液和洗脫液中咪唑的濃度，收集蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)并對(duì)比，選擇洗脫后雜帶較少且目的蛋白較多的相應(yīng)咪唑濃度的洗滌液和洗脫液，在該條件下大量純化目的蛋白。

1.4 動(dòng)物免疫

將純化的CD133重組蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1劑量混合并充分乳化，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方法免疫BALB/c小鼠（100 μg/只），于第3周和第4周各加強(qiáng)免疫1次（100 μg/只，不完全弗氏佐劑），共免疫3次。最后一次免疫后的第3天，摘眼球采血，分離血清，于-70℃冰箱中保存。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

取10 μg CD133重組蛋白在12%凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，與稀釋比例1∶200～1∶1×104的小鼠血清在4℃條件下孵育過(guò)夜。用TBST（Tris buffered saline Tween）洗膜3次，每次10 min，之后與辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶1 000）于室溫條件下孵育1 h；再用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法顯影。以未經(jīng)CD133重組蛋白免疫的小鼠血清（1∶1 000）為陰性對(duì)照。

1.6 免疫組化染色

采取肉雞肺組織，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片。撈取相鄰2張切片，脫蠟和進(jìn)水后，用3%H2O2室溫避光處理10 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后，置于三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）緩沖液（Tris 1.21 g/L，EDTA 0.37 g/L，Tween-20 0.5 mL，pH 9.0）中進(jìn)行高壓熱修復(fù)[12]。于5%牛血清白蛋白（BSA）中室溫封閉20 min，滴加自制的CD133抗血清（1∶50）于4℃條件下孵育過(guò)夜，用PBS清洗3次，每次10 min；滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h后，用PBS溶液清洗3次，每次10 min，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。以未經(jīng)CD133重組蛋白免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD133跨膜區(qū)及親水性分析結(jié)果

利用TMHMM Server 2.0軟件進(jìn)行跨膜螺旋分析發(fā)現(xiàn)，禽CD133具有5個(gè)跨膜區(qū)、3個(gè)胞外區(qū)和3個(gè)胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)分別位于肽鏈的第1～107位、182～438位和509～795位氨基酸處。選擇N端第19～107位氨基酸構(gòu)成的肽段進(jìn)行親水性分析，發(fā)現(xiàn)這一肽段的親水性評(píng)分較高。

2.2 CD133胞外域基因合成

以肉雞肺組織提取的cDNA為模板，擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為300 bp的片段，與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度（279 bp）相符（圖1）。

圖1 目的基因CD133擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Amplified products of the targeted gene CD133 on 1.5%agarose gel electrophoresis

2.3 pET-28a-CD133重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)pET-28a-CD133重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得一條長(zhǎng)度約為300 bp的條帶（圖2），與目的片段長(zhǎng)度相符。將質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的片段基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，表明插入序列完全正確。上述結(jié)果表明，pET-28a-CD133重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-CD133雙酶切產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Products of the recombinant plasmid pET-28a-CD133 digested by enzymes BamHⅠand XhoⅠon 1%agarose gel electrophoresis

2.4 CD133誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果

將上述克隆正確的pET-28a-CD133質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并小量擴(kuò)增，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在包涵體中檢測(cè)到一條分子質(zhì)量在10～15 kDa之間的特異條帶（圖3A），與目的蛋白大?。?4.4 kDa）相符。進(jìn)一步大量培養(yǎng)重組子，用8 mol/L脲溶解包涵體，鎳柱親和層析后得到較高純度的重組蛋白（圖3B）。

2.5 CD133抗血清對(duì)CD133重組蛋白的識(shí)別反應(yīng)

CD133重組蛋白可被鼠抗禽CD133血清特異性結(jié)合，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)單一條帶。抗CD133血清經(jīng)1×104倍稀釋后仍可與CD133重組蛋白結(jié)合，而未免疫CD133蛋白的小鼠血清則不能識(shí)別CD133重組蛋白（圖4）。

2.6 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

以鼠抗禽CD133抗血清為一抗，羊抗小鼠IgG為二抗，按常規(guī)免疫組化法進(jìn)行染色后，可見(jiàn)肺血管內(nèi)膜中有CD133陽(yáng)性細(xì)胞分布（圖5A）；而使用未經(jīng)CD133蛋白免疫的小鼠血清作為一抗進(jìn)行免疫組化染色后，同一血管的內(nèi)膜無(wú)明顯的顏色反應(yīng)（圖5B）。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 Detection of recombinant protein by SDS-PAGE

圖4 不同稀釋比例的鼠抗禽CD133血清對(duì)CD133重組蛋白識(shí)別的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Fig.4 Recognition of different dilution ratios of mouse antiavian CD133 serum with recombinant CD133 by Western-blotting

圖5 肉雞肺血管中CD133陽(yáng)性細(xì)胞的免疫組化法檢測(cè)Fig.5 Detection of CD133 positive cells in pulmonary vascular of chicken by immunohistochemistry

3 討論

已有研究表明，哺乳動(dòng)物CD133蛋白具有3個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，其中第1個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域具有良好的抗原性[15]。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)禽CD133的跨膜螺旋進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)禽CD133蛋白亦具有3個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，其N(xiāo)端胞外結(jié)構(gòu)域由107個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，去除信號(hào)肽后剩余89個(gè)氨基酸殘基。親水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該胞外結(jié)構(gòu)域具有較好的親水性?；谏鲜錾镄畔W(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，我們選擇該肽段為候選抗原來(lái)制備抗禽CD133抗體。

本研究首先以肉雞肺組織cDNA為模板，擴(kuò)增出禽CD133蛋白N端胞外區(qū)編碼序列，進(jìn)而采用原核表達(dá)的方式成功制備出CD133重組蛋白。用純化后的重組蛋白免疫小鼠，收集血清，檢測(cè)抗血清對(duì)CD133的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)CD133重組蛋白免疫的小鼠血清可特異性識(shí)別CD133重組蛋白，經(jīng)1∶1×104的比例稀釋后仍保持對(duì)CD133重組蛋白的結(jié)合能力，提示抗血清制備成功。由于血管內(nèi)皮中含有表達(dá)CD133標(biāo)志的EPCs[16]，本研究隨后采用免疫組化法驗(yàn)證了CD133抗血清是否可識(shí)別血管內(nèi)皮中的EPCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用抗CD133血清作為一抗染色后，肉雞肺血管內(nèi)皮中出現(xiàn)大量棕黃色細(xì)胞，而用未經(jīng)CD133免疫的小鼠血清作為一抗染色后，血管內(nèi)皮中無(wú)顏色反應(yīng)。上述結(jié)果表明，本研究制備的抗CD133多克隆抗體可用于檢測(cè)組織中的CD133陽(yáng)性細(xì)胞。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究利用禽CD133蛋白N端胞外結(jié)構(gòu)域重組蛋白為抗原，成功制備出了抗禽CD133多克隆抗體，為開(kāi)展相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。