張守平，申汶濤，王麗榮，張百重3*

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100192；3.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

A型流感病毒是引發(fā)流感的重要病原，可以感染多種動(dòng)物，引起發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等呼吸系統(tǒng)疾病以致全身嚴(yán)重?cái)⊙Y等多種癥狀。經(jīng)A型流感病毒感染后的復(fù)雜致病機(jī)制一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。殺傷性T細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）在病毒的清除中發(fā)揮重要作用，其作用方式為直接裂解被感染細(xì)胞或釋放γ-干擾素（interferon-γ,IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）等促炎性細(xì)胞因子，有效控制流感病毒感染。CD8+T缺乏的小鼠感染流感病毒后呈現(xiàn)出更高的易感性和病毒復(fù)制量[1]。輔助性T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）通過分泌IFN-γ、白介素-2（interleukin-2,IL-2）和TNF-α等來促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和維持CD8+T細(xì)胞功能，而缺乏CD4+T細(xì)胞的小鼠呈現(xiàn)出流感病毒清除延遲的現(xiàn)象[2]。因此，CD4+T和CD8+T細(xì)胞在抗流感感染免疫中發(fā)揮著重要的作用。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信號(hào)通路對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖、分化等過程具有重要的調(diào)控作用[3]。c-Jun是一種原癌蛋白，也是JNK通路發(fā)揮作用的一種下游轉(zhuǎn)錄因子。在流感病毒感染的早期，可以檢測(cè)到c-Jun活化蛋白，而其在流感病毒感染過程中是否對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮作用還不清楚。核酶Dz13是一種可以特異性切割并降解c-Jun蛋白的DNA分子，即一種脫氧核酶，目前已經(jīng)很成熟地應(yīng)用在抗腫瘤、細(xì)胞遷移等方面的研究中。有研究顯示，使用Dz13阻斷c-Jun蛋白可以在體外抑制單核-內(nèi)皮細(xì)胞聚集，在大鼠炎癥模型中阻止白細(xì)胞黏附、滲出[4]。但是關(guān)于Dz13應(yīng)用于病毒感染所引起的細(xì)胞增殖或分化等的報(bào)道則很少。在本研究中，通過建立H1N1流感病毒感染模型，使用Dz13抑制c-Jun蛋白的表達(dá)，從而探討c-Jun蛋白對(duì)病毒感染后小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：6～8周齡無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級(jí)雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量（20±1.5）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠盒（individually ventilated cages,IVC）系統(tǒng)內(nèi)。

病毒：H1N1（A/PR/8/34）流感病毒毒株，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國家動(dòng)物寄生原蟲實(shí)驗(yàn)室保存，于9日齡SPF級(jí)雞胚尿囊腔傳代后，測(cè)定對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（median lethal dose,LD50），分裝后于-80℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

核酶Dz13和對(duì)照序列Dz13scr：核酶Dz13的序列（5′-CGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGA GGCGTTG-Ti-3′）和Dz13scr的序列（5′-GCGACG TGAGGCTAGCTACAACGAGTGGAGGAG-Ti-3′）由華大基因合成。用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）溶解至質(zhì)量濃度為2 mg/mL，于-20℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

試劑：FITC Rat Anti-mouse CD4和PE Antimouse CD8抗體購自美國eBioscience公司；紅細(xì)胞裂解液購自中科邁晨科技有限公司；TRIzol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；p-c-Jun和c-Jun蛋白抗體為美國CellSignalTechnology（CST）公司產(chǎn)品；FuGENE?6為美國Promega公司產(chǎn)品。其余常規(guī)試劑為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)儲(chǔ)存的藥品。

1.2 方法

小鼠攻毒：將小鼠隨機(jī)分為Dz13+H1N1、DZ13scr+H1N1、PBS+H1N1、PBS 4組，每組 9只。肌內(nèi)注射Zoletil?（16.5 mg/kg）以麻醉小鼠，隨后將3 LD50/只H1N1流感病毒溶于50 μL PBS中，以滴鼻方式給予小鼠。

小鼠給藥：以感染病毒時(shí)計(jì)為0 d，在感染的0和 3 d，將 Dz13 和 Dz13scr（2.5 mg/kg）溶于 50 μL PBS（含2.5 μL FuGENE6和1 mmol/L MgCl2）中，以滴鼻方式給予小鼠。

外周血內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)：于感染后3和6 d時(shí)，每組小鼠各取3只，摘取眼球采血并處死。收集經(jīng)抗凝劑處理的外周血200 μL，1 000 r/min離心3 min，棄上清液；加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打均勻，室溫靜置10 min，1 000 r/min離心5 min，棄掉上層紅色液體；收集沉淀部分，加入1 mL PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入0.5 mL PBS重懸，加入FITCAnti-mouse CD4抗體和PE Anti-mouse CD8抗體，混勻，避光靜置約20 min；用BDAccuri?C6 Plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

用蛋白質(zhì)印跡法（Western-blotting,WB）檢測(cè)肺內(nèi)c-Jun蛋白的表達(dá)：在取下來的肺組織（大約全肺的1/3）中加入1 mL RIPA蛋白裂解液[含10 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）]，在低溫條件下用玻璃研磨器將組織勻漿。在冰上作用30 min后，以1.2×104r/min離心10 min，取上清液。按比例加入上樣緩沖液，煮沸10 min。用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后，將各組蛋白樣品質(zhì)量濃度調(diào)整為2 μg/μL，取18 μL樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE），用濕轉(zhuǎn)法將蛋白膠樣品于60 V電壓下2 h內(nèi)轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）上。用5%脫脂奶粉室溫封閉l h。一抗用p-c-Jun（1∶1 000）抗體、c-Jun（1∶1 000）抗體和β-tubulin（1∶1 000）抗體孵育過夜（4℃），用0.5%PBST溶液洗膜后，用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。經(jīng)0.5%PBST溶液洗膜后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色并進(jìn)行結(jié)果分析。

用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)肺內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)：取100 μL外周血，用紅細(xì)胞裂解液裂解后，1 000 r/min離心10 min，收集沉淀細(xì)胞。按照TRIzol說明書提取各組細(xì)胞總RNA。取2 μg總RNA，按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性90 s；95 ℃退火5 s，58 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。獲得各樣本待測(cè)基因的擴(kuò)增循環(huán)閾值（CT）值，采用 2-△△CT

法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。引物序列見表1。

表1 細(xì)胞因子的引物序列Table1 Primer sequences of the target cytokines

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件作圖。采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析及Tukey事后檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dz13對(duì)c-Jun蛋白表達(dá)的抑制作用

用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織內(nèi)c-Jun蛋白的表達(dá)量，結(jié)果（圖1）表明：小鼠攻毒后，與未感染組（PBS）相比，肺內(nèi)c-Jun（p-c-Jun）蛋白的活化水平明顯上調(diào)，隨著感染后時(shí)間的遞增，在6 d時(shí)肺內(nèi)c-Jun蛋白的活化程度明顯低于3 d時(shí)的水平。Dz13用藥組（Dz13+H1N1）c-Jun蛋白（t-c-Jun）的表達(dá)受到抑制，在3 d時(shí)的抑制水平高于6 d，隨著t-c-Jun蛋白表達(dá)受到抑制，活化的c-Jun蛋白表達(dá)量也隨之降低。說明病毒感染后可以引起c-Jun蛋白的活化，核酶Dz13可以特異性地抑制c-Jun蛋白表達(dá)及其活化。

圖1 Dz13對(duì)病毒感染小鼠肺內(nèi)c-Jun蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Dz13 on c-Jun protein expression in lungs of infected mice

2.2 c-Jun蛋白對(duì)病毒感染引起的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞增殖的影響

病毒感染機(jī)體后，可以迅速激起機(jī)體的免疫反應(yīng)。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染后3和6 d小鼠外周血內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，結(jié)果（圖2）表明：小鼠感染病毒后，外周血內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比明顯增多；而核酶Dz13用藥組與Dz13scr相比，CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖受到抑制（P＜0.05）。說明c-Jun蛋白參與調(diào)節(jié)流感病毒感染后小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖。

圖2 Dz13對(duì)病毒感染小鼠外周血內(nèi)CD4＋（A）和CD8＋（B）T細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Dz13 on proliferation of CD4＋(A)and CD8＋(B)T cells in peripheral blood of infected mice

2.3 c-Jun蛋白對(duì)病毒感染后引起的細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

流感病毒感染后一個(gè)特征性變化就是細(xì)胞因子表達(dá)量的上調(diào)。在本研究中，為測(cè)定c-Jun蛋白對(duì)病毒感染后細(xì)胞因子表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用，我們使用qRT-PCR測(cè)定感染后3和6 d小鼠外周血內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。從圖3中可見：病毒感染后，細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10明顯地上調(diào)表達(dá)；Dz13用藥后，Dz13+H1N1組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10表達(dá)量明顯低于Dz13scr+H1N1組和PBS+H1N1組（P＜0.05）。說明c-Jun蛋白參與調(diào)節(jié)流感病毒感染后細(xì)胞因子的表達(dá)。

圖3 Dz13對(duì)病毒感染小鼠外周血內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of Dz13 on cytokine expression in peripheral blood of infected mice

3 討論

原癌蛋白c-Jun和c-fos以異二聚體的形式組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1（activator protein-1），AP-1可以調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，是JNK通路中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要分子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等的調(diào)節(jié)過程。大量研究證實(shí)：在流感病毒感染的早期可以檢測(cè)到c-Jun活化蛋白（p-c-Jun），并啟動(dòng)下游IFN-β等一些抗病毒細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄；抑制c-Jun蛋白表達(dá)后能夠?qū)е翴FN-β轉(zhuǎn)錄水平降低，病毒繁殖率升高[5-6]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，JNK-/-小鼠可抑制感染后引起的CD8+T細(xì)胞的增殖[7]。而c-Jun蛋白作為JNK通路的效應(yīng)因子是否參與流感病毒感染后CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖還不清楚。在本研究中，阻斷小鼠體內(nèi)c-Jun蛋白的表達(dá)后，流感病毒感染后c-Jun蛋白的活化明顯降低，外周血內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖均受到抑制。進(jìn)一步證實(shí)了c-Jun蛋白作為JNK通路的效應(yīng)分子，在流感病毒感染后所引起c-Jun蛋白的活化，參與了T細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)等的調(diào)節(jié)。

脫氧核酶DRz是人工合成的具有酶活性的DNA分子，能在一定條件下識(shí)別并結(jié)合靶底物mRNA于配體結(jié)合部位形成螺旋，催化切割后與之分離，再結(jié)合其他底物，從而持續(xù)地抑制底物基因的表達(dá)。因其廉價(jià)、低毒、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為分子生物醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。c-Jun蛋白在肺癌、肝癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，因此，c-Jun蛋白在腫瘤及抗感染治療中可以作為一個(gè)有效靶點(diǎn)而存在。Dz13作為脫氧核酶的一種，通過與c-Jun核酸序列的特異識(shí)別，發(fā)揮基因表達(dá)抑制效應(yīng)和高效的剪切活性。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在抗皮膚癌、血管形成、細(xì)胞增殖遷移等方面的研究中[8-9]。將Dzl3體外轉(zhuǎn)染至人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)c-Jun蛋白表達(dá)減少，裸鼠皮膚鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤等皮膚癌細(xì)胞的遷移、侵襲受到抑制[10]。在本研究中，Dz13作用于流感病毒感染小鼠后，可以明顯抑制流感病毒感染引起的c-Jun蛋白的活化和表達(dá)及CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和炎性因子的上調(diào)表達(dá)。此研究結(jié)果提示我們，在流感病毒感染后可以通過使用特異性Dz13阻斷c-Jun蛋白表達(dá)來抑制感染后的過度炎性反應(yīng)。結(jié)合Dz13的諸多優(yōu)勢(shì)，其在抗病毒感染應(yīng)用中將具有重要的潛能，可以為抗病毒藥物的篩選提供參考。