呂靖雯，劉 蕊，李國華，李紅葉*，王洪凱*

（1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物病蟲害分子生物學(xué)重點實驗室/浙江省植物病原和昆蟲生物學(xué)重點實驗室/浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州310058；2.梅州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東梅州514021）

枝孢屬（Cladosporium Link）真菌廣泛分布于全球，幾乎在任何環(huán)境中都可以發(fā)現(xiàn)這類真菌[1-3]。許多枝孢屬真菌是腐生菌，可經(jīng)常從土壤和腐爛的植物材料上分離得到，然而一些枝孢屬真菌是植物的重要病原物，主要侵染葉片，也可以侵染植物枝條和果實，造成植物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，還有一些枝孢屬真菌可以侵染動物甚至人類，引起疾病[4-6]。

枝孢屬真菌的形態(tài)特征變化范圍大，不同種類的形態(tài)特征重疊較大，種類鑒定比較困難[3-7]。因此，一些常見的種類被認(rèn)為是復(fù)合種，如枝狀枝孢（C.cladosporioides）、多 主 枝 孢（C.herbarum/sphaerospermum）等[7]。應(yīng)用多基因片段的系統(tǒng)學(xué)分析表明，許多形態(tài)相似的種類（復(fù)合種）可以分為多個系統(tǒng)學(xué)種。目前，已經(jīng)超過170個形態(tài)學(xué)種通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行了研究，結(jié)合形態(tài)特征，被重新檢查定義。采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對來源于不同基質(zhì)、不同環(huán)境中的枝孢屬真菌的多樣性進(jìn)行研究是目前此類真菌的研究熱點之一，并不斷有新種被發(fā)現(xiàn)[1，3-4]。

蕓香科植物中的柑橘是世界上最重要的果樹之一。據(jù)報道，從蕓香科植物上分離到的枝孢屬真菌種類已經(jīng)有10個，其中有3個是植物病原菌。一般認(rèn)為，擬蕓香枝孢霉（C.haplophylli）是寄生擬蕓香屬（Haplophyllum）植物的專性寄生菌，蕓香枝孢霉（C.rutae）是寄生蕓香屬（Ruta）植物的專性寄生菌，皺面枝孢霉（C.corrugatum）是柑橘屬的專性寄生菌。而多米尼加枝孢（C.dominicanum）、耐鹽枝孢霉（C.halotolerans）、多主枝孢（C.herbarum）、伊朗枝孢霉（C.iranicum）、尖孢枝孢（C.oxysporum）、球孢枝孢（C.sphaerospermum）和極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）以腐生為主，但經(jīng)常作為次生侵染物，在植物組織老化或受傷情況下，入侵死亡的細(xì)胞和組織。而有關(guān)我國柑橘上的枝孢屬真菌的研究很少。

柚[Citrus grandis Osbeck,Syn.C.maxima(Burm.)Merr.]是我國重要的柑橘類水果（包括寬皮類柑橘、橙、柚、檸檬、金橘和佛手）之一，產(chǎn)品以鮮銷為主，果實的外觀品質(zhì)對果品的價格影響很大。已知柚果實果面主要病害有黑點?。―iaporthe citri，也稱砂皮?。?、黑斑?。≒hyllosticta citriasiana）和脂斑病（Zasmidium spp.）[8-9]，然而我們在走訪果園和進(jìn)行市場調(diào)查時，還時常可發(fā)現(xiàn)一種不同于上述3種病害的斑點病，因此，我們對這類斑點病的病斑菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對獲得的20株疑似枝孢菌菌株進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與分離培養(yǎng)

在2015年11月—2016年2月間，從我國廣東、廣西、福建等?。ㄗ灾螀^(qū)）的沙田柚和琯溪蜜柚上采集具有典型病斑的果實共計60個，帶回實驗室進(jìn)行病菌分離培養(yǎng)。分離所使用的培養(yǎng)基為常規(guī)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基和合成低營養(yǎng)瓊脂（synthetic low-nutrient agar,SNA）培養(yǎng)基，其中SNA培養(yǎng)基的配方為KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g,葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL，高溫滅菌，備用。

由于大部分病斑上都沒有明顯的子實體，病菌的分離采取組織分離法：將果面用清水洗凈，吸水紙擦干，用75%乙醇棉球反復(fù)擦洗病斑，待乙醇揮發(fā)后，用滅菌的手術(shù)刀從病斑的邊緣取小塊組織（0.2 cm×0.2 cm），置于含有質(zhì)量濃度各為0.1 mg/mL的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素的PDA平板中央，培養(yǎng)7 d，待有菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行培養(yǎng)，待其產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢分離純化。將獲得的純化菌株編號并保存在PDA斜面試管中，在4℃冰箱中貯藏，待用。

1.2 菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性觀察

從斜面中挑取菌株接種到PDA平板上，于24℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d后，從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，移至直徑為9 cm的PDA、SNA培養(yǎng)基平板上，于24℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d后，觀察菌落的顏色、形狀，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速率。各菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和形態(tài)顯微觀測按照BENSCH等[3]的方法進(jìn)行，利用光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征，測量其大小并進(jìn)行顯微拍攝[1，7]。

1.3 DNA提取與序列分析

從培養(yǎng)7 d的PDA平板上用滅菌手術(shù)刀刮取足量的菌絲，置于離心管內(nèi)，采用改進(jìn)的CTAB法提取DNA，貯藏于-20℃冰箱中，待用[8]。采用真菌核糖體rDNA通用引物ITS4/ITS5、真菌轉(zhuǎn)錄延長因子基因通用引物EF-1-F/EF-1-R和微絲蛋白基因通用引物ACT-F/ACT-R對分離得到的菌落進(jìn)行相應(yīng)的序列擴(kuò)增；引物由擎科生物公司合成，序列見表1。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×MasterMix 12.5 μL，補(bǔ)充無菌水至 25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度：ITS 58 ℃，EF 55 ℃，ACT 61℃），72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送至擎科生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAman軟件進(jìn)行初步編輯和對比，后提交至GenBank與相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 系統(tǒng)樹的構(gòu)建

將測序獲得的3種序列經(jīng)Bioedit校正后聯(lián)合排列，采用ClustalX[10]和Bioedit[11]軟件進(jìn)行分析。采用PAUP 4.0b10[12]軟件的非加權(quán)簡約法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。系統(tǒng)樹分支的穩(wěn)定性采用重復(fù)1 000次的自舉法（bootstrap）進(jìn)行評估[13]。

表1 研究中所用的引物Table1 Primers used in this research

1.5 致病性測定

供試的極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）菌株為GDMZ9和GDMZ29，散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）菌株為GX23和GDMZ32，在PDA平板上培養(yǎng)7 d，接種對象為健康無病的琯溪蜜柚。首先用體積分?jǐn)?shù)為2%的洗潔精浸泡果實5 min，清水充分沖洗，擦干，再用75%乙醇對全果進(jìn)行表面擦拭消毒，置于超凈工作臺上，待乙醇揮發(fā)完后，用滅菌的接種針刺3～5個深度約2 mm的傷口，然后將直徑為5 mm的菌餅的菌絲面朝下貼至傷口處，對照組貼上相同直徑的PDA培養(yǎng)基。將接種后的果實罩上干凈的保鮮袋，在25℃條件下光暗交替保濕培養(yǎng)，15 d后觀察癥狀出現(xiàn)情況，并從接種的發(fā)病病斑上再次分離病原。每組3次重復(fù)，整個接種試驗重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚果面枝孢菌斑點病的癥狀

病斑多出現(xiàn)在已轉(zhuǎn)色的果實上，病斑初始為芝麻粒大小，近圓形或不規(guī)則形，紅褐色小點，病斑稍凹陷，后期病斑中央逐漸變?yōu)楹诤稚?，凹陷更明顯（圖1）。在潮濕環(huán)境下病斑上可見少量的黑色霉層。病斑僅限于果皮，不深入白皮層和囊瓣而造成腐爛，因此，僅影響果實的外觀品質(zhì)和商品性。

2.2 病菌的分離結(jié)果

從60個帶病果實的發(fā)病部位共分離到93個菌株。根據(jù)菌落形態(tài)，結(jié)合標(biāo)本來源分布，選擇21株代表性菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究?；诜稚咦有螒B(tài)特征的初步鏡檢結(jié)果，確定20個菌株為枝孢屬（Cladosporium）真菌（表2）。

圖1 柚果田間癥狀和菌株致病性接種癥狀Fig.1 Symptoms of fruit spot disease on C.grandis and the pathogenicity of the pathogen on fruits

2.3 致病性測定結(jié)果

用極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）和散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）這2個菌株分別接種琯溪蜜柚果實后，均可引起發(fā)病，接種點的發(fā)病率為100%。接種7 d后即可見刺傷處出現(xiàn)紅褐色、略凹陷的病斑，到接種15 d后，病斑有所擴(kuò)展，顏色有所加深，凹陷更為明顯。病斑僅限于果皮，不深入白皮層和囊瓣，癥狀與田間觀察到的（圖1）基本一致。從接種發(fā)病的部位可分離獲得與接種相一致的真菌，完成了柯赫氏法則驗證。

表2 本研究的菌株來源和序列信息Table2 Source of fungal strains and sequence information used in this research

2.4 柚果枝孢斑點病病原菌的形態(tài)特征

對分離到的20個枝孢屬真菌菌株的形態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，可以將其分為2個組。第1組包括18個菌株，在PDA培養(yǎng)基、25°C條件下培養(yǎng)2周后的菌落直徑達(dá)8.2～8.7 cm，呈橄欖色至深褐色，表面呈絨毛狀。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)特征（圖2）與極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）[1]相同：菌絲直徑1～5 μm，分支，淺褐色，光滑；分生孢子梗豎立，中間有粗節(jié)，隔膜，單生或2～3根簇生，稍有分支，長可達(dá)400 μm，寬2.5～4.0 μm；產(chǎn)孢細(xì)胞有限生長，圓柱狀，膝狀彎曲，大小為（10～44）μm×（3～4）μm；枝孢無隔，短圓柱狀或圓柱狀，大小為（22～41）μm×（3～5）μm，淺褐色；分生孢子鏈生，分支，淺綠褐色，末端分生孢子大小為（2～5）μm×（2～3）μm，中間分生孢子大小為（4～12）μm×（2～4）μm。

續(xù)表2 Continuation of Table 2

第2組包括2個菌株，GX23和GDMZ32，在PDA培養(yǎng)基、25°C條件下培養(yǎng)2周后的菌落直徑為6.2～6.5 cm，呈橄欖色至深褐色，表面呈絨毛狀。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其形態(tài)特征（圖3）與散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）[5]相同：菌絲直徑1.5～3.0 μm，淺褐色，光滑；分生孢子梗豎立，微彎，無節(jié)，有隔膜，單生，稍有分支，長可達(dá)210 μm，寬2～4 μm；產(chǎn)孢細(xì)胞有限生長，圓柱狀，膝狀彎曲，大小為（12～32）μm×（3～4）μm；枝孢無隔，短圓柱狀或圓柱狀，大小為（18～36）μm×（2.0～3.5）μm，淺褐色；分生孢子鏈生，分支，淺綠褐色，末端分生孢子大小為（4～5）μm×（2.0～2.5）μm，中間分生孢子大小為（5～7）μm×（2.5～3.5）μm。這個種在2016年才建立，本研究是首次從植物材料上分離到此種真菌。

圖2 從柚果面枝孢菌斑點上分離到的極細(xì)枝孢的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of C.tenuissimum from Cladosporium spot of C.grandis

圖3 從柚果面枝孢菌斑點上分離到的散黃枝孢霉的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of C.xantochromaticum from Cladosporium spot of C.grandis

2.5 柑橘果斑病病原的多基因片段系統(tǒng)學(xué)分析

對21個分離物的核糖體基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（ITS）區(qū)、轉(zhuǎn)錄延長因子（TEF）基因區(qū)段和微絲肌動蛋白（ACT）基因區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增并測序，將得到的3個區(qū)段的核苷酸序列合并，并從GeneBank中下載已經(jīng)報道的枝孢屬真菌在柑橘上分離到的種及其相似種，與分離物同時進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，最終形成了總計1 004個特征符的數(shù)據(jù)陣，其中進(jìn)行簡約法聚類的特征符是342個。聚類結(jié)果（圖4）表明，與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果相符，其中18個菌株與極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）聚成一類，2個菌株與散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）聚成一類，這2個聚類分支結(jié)果得到了自舉（boostrap）檢驗的支持。而GDMZ23自成一個與枝孢屬真菌分離的分支，經(jīng)形態(tài)鑒定表明，此菌株與HUANG等[9]對果實平臍疣孢菌（Zasmidium fructigenum）的形態(tài)描述一致，DNA序列分析結(jié)果與形態(tài)分析結(jié)果相符。

3 討論與結(jié)論

枝孢屬真菌是自然界廣泛存在的一類真菌，甚至在一些極端環(huán)境中也有這類菌的存在[1，7]。大多數(shù)枝孢屬真菌是腐生菌，少數(shù)可以在植物和動物，甚至人類上寄生[5]。植物的枝孢屬真菌病原物一般危害葉片，在許多植物葉片上形成病斑[1]。我國在許多植物葉片上均發(fā)現(xiàn)了枝孢屬病原真菌，但在柑橘果實上的枝孢屬真菌鮮見報道。柚是柑橘屬的重要種類，經(jīng)濟(jì)價值很高，但對其果實病害的研究很少。本研究發(fā)現(xiàn)，枝孢屬病原真菌至少有2個種可以侵染沙田柚和琯溪蜜柚果實，在果實表面形成病斑，嚴(yán)重影響柚果商品性，需要引起高度重視。

本研究表明，極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）是柑橘果斑病的主要病原菌。在分類上，極細(xì)枝孢菌是一種常見的枝孢屬真菌，在全世界許多地方都有分布，主要是腐生菌，少數(shù)是寄生性較弱的次生寄生菌[1，3，7]。BENSCH 等[2-3]認(rèn)為極細(xì)枝孢是一個復(fù)合種，包含遺傳背景不同的種群，許多特征重疊在一起，在形態(tài)上難以明確區(qū)分；但是通過分子系統(tǒng)學(xué)分析表明，這個種內(nèi)部分化比較明顯，可以根據(jù)DNA序列劃分成不同的組群。本研究發(fā)現(xiàn)，在我國柚果實表面分離到的枝孢霉分離物絕大部分屬于極細(xì)枝孢（C.tenuissimum），是優(yōu)勢種。而且從聚類結(jié)果可以看出，來自不同地方的菌株聚類在一起，但其致病性是否與其他組群不同，值得進(jìn)一步研究。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，柚果的果面病只有當(dāng)果實即將成熟或者已經(jīng)成熟時才形成病斑，病害不會在幼果上發(fā)生。從這個侵染特點推測該病菌是弱寄生菌。

圖4 柚果面枝孢菌斑點病病原分離物的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenic analysis of isolates from Cladosporium spot of C.grandis

散 黃 枝 孢 霉（C.xantochromaticum）是SANDOVAL-DENIS等[6]根據(jù)從臨床樣本中分離得到的菌株的特征建立的一個新種：對這個種的形態(tài)特征分析表明，它屬于枝狀枝孢（C.cladosporioides）復(fù)合種；對其分子序列特征分析表明，它與同屬于枝狀枝孢（C.cladosporioides）復(fù)合種中的細(xì)孢枝孢（C.perangustum）親緣關(guān)系很近，并認(rèn)為細(xì)孢枝孢（C.perangustum）不同菌株間具有相當(dāng)大的遺傳變異。本研究的系統(tǒng)學(xué)分析也得到了相似的結(jié)果，散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）和細(xì)孢枝孢（C.perangustum）的親緣關(guān)系很近。且本研究從沙田柚果實上分離到的2株菌與散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）的菌株明顯地聚類在一起，形態(tài)上也與SANDOVAL-DENIS等[6]對散黃枝孢霉的描述相一致。這是首次從植物上分離到的散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）。但從植物上分離到的散黃枝孢霉與從臨床樣本中分離到的散黃枝孢霉菌株在生理生化和致病性方面的區(qū)別還值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，柚果實上的枝孢果斑病主要由極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）和散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）引起，其中極細(xì)枝孢（C.tenuissimum）是優(yōu)勢種，而散黃枝孢霉（C.xantochromaticum）是從柚果上分離到的我國的新記錄種。這2個種在侵染循環(huán)過程中的異同及侵染過程中是否有協(xié)同作用，需要進(jìn)一步研究，從而為制定科學(xué)的防治措施提供理論指導(dǎo)。