王繼群， 魏然茹， 宋 月， 劉俊杰， 程秀珍， 李 婧*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

槲皮素金屬配合物具有較強(qiáng)生理活性，如，抗炎、抗病毒、抗腫瘤等[1-3]。其生理活性通常強(qiáng)于槲皮素單體，一方面，由于配合物溶解性很大程度改善了槲皮素本身的溶解性，另一方面，金屬離子參與作用具有加強(qiáng)生物活性的作用[4-5]。槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性研究是熱門課題之一，作用機(jī)理[6]其一為金屬配合物可以插到DNA的堿基對(duì)，與DNA產(chǎn)生強(qiáng)烈的鍵合作用，從而影響DNA分子的內(nèi)部構(gòu)型，抑制了分子的遺傳與復(fù)制。配合物與DNA作用主要有3種形式：非共價(jià)鍵作用(靜電結(jié)合、插入結(jié)合和溝區(qū)結(jié)合)、共價(jià)結(jié)合、剪切作用。配合物通常采用插入和部分插入的模式與DNA作用，在一定濃度下展現(xiàn)裂解DNA的作用[7]。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸銅和新戊酸銅與槲皮素反應(yīng)，具有雙齒配位性能的新戊酸根和苯甲酸根，參與槲皮素銅配合物的形成，生成多種形式的配合物，推測(cè)結(jié)構(gòu)如圖1所示[8]：配合物1由新戊酸銅或苯甲酸銅與槲皮素反應(yīng)得到，其結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道相同，配合物2為新戊酸銅與槲皮素的產(chǎn)物，配合物3為苯甲酸銅與槲皮素的產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，這幾個(gè)配合物具有較強(qiáng)的腫瘤抑制作用[8]。

圖1 配合物分子結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3個(gè)配合物通過紫外光譜和凝膠電泳方法研究配合物與pBR322 DNA的作用形式與裂解能力，探究3種配合物的DNA作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與藥品

紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀，由KBr壓片法測(cè)定；凝膠成像使用美國(guó)BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)分析；紫外光譜在thermo scientific紫外分光光度計(jì)上測(cè)定。

配合物參照文獻(xiàn)方法制備[8]，生化燃料溴化乙錠，EB北京博奧拓達(dá)科技有限公司；超螺旋pBR322 DNA，美國(guó)Fermentas公司；瓊脂糖，Spanish公司；其他試劑均為分析純。

1.2 配合物的合成

配合物1：槲皮素(4 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入新戊酸銅或苯甲酸銅(1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產(chǎn)物。IR(KBr,cm-1)：3 480 b～3 272 b,1 650 s，1 599 s,1 508 s,1 432 w,1 369 w,1 321 w,1 271 s,1 208 w,1 098 w,1 016 w,824 w,625 w。

配合物2：槲皮素(2 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入新戊酸銅(1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產(chǎn)物。IR(KBr,cm-1)：3 510 b～3 315 b,2 967 w,1 640 m,1 597 s,1 536 m,1 484 s,1 415 w,1 357 m,1 320 m,1 268 s,1 201 w,1 094 w,813 w,624 w。

配合物3：槲皮素(2 mmol)溶解于熱的無水乙醇(50 mL)，加入苯甲酸銅(2 mmol)，攪拌回流1 h，趁熱抽濾后得黑色產(chǎn)物。IR(KBr,cm-1)：3 510 b～3 315 b,2 967 w,1 640 m,1 597 s,1 536 m,1 484 s,1 415 w,1 357 m,1 320 m,1 268 s,1 201 w,1 094 w,813 w,624 w。

1.3 配合物與pBR322 DNA作用的紫外光譜

用甲醇溶解槲皮素和配合物1、2、3，然后用5 mmol/L Tris-NaCl-HCl、pH值為7的緩沖液稀釋至槲皮素為4.0×10-5mol/L，配合物為2.0×10-5mol/L，pBR322 DNA用Tris-NaCl-HCl緩沖液稀釋至0.125 μg/μL備用。參比池中加入380 μL緩沖液，樣品池中加入380 μL樣品溶液，在200 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，再向參比池和樣品池中分別加入相同體積(1 μL/次)的0.125 μg/μL pBR322DNA，共加入5 μL，然后分別測(cè)定溶液的紫外吸收光譜圖。

1.4 配合物對(duì)pBR322 DNA的裂解實(shí)驗(yàn)

槲皮素銅配合物對(duì)pBR322 DNA的切割活性由瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定。用DMSO將槲皮素銅配合物稀釋成7個(gè)質(zhì)量濃度，分別為500、250、125、62.5、31.25、15.63、3.91 μg/mL。在每個(gè)EP管中加1 μL槲皮素配合物溶液，然后，加入Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液8 μL，最后，加入1 μL pBR322 DNA(0.25 μg/μL)混合，總體積10 μL；同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照組，混合溶液放置在37 ℃恒溫水浴中避光反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，從EP管中取3 μL產(chǎn)物與1 μL loading buffer混合，上樣到含有1.0 μg/mL溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠板，使用TAE緩沖溶液，在80 V/cm電壓下電泳，使用美國(guó)BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜分析

金屬配合物分子的特征吸收譜帶會(huì)在加入DNA后發(fā)生變化。如發(fā)生插入作用，則該分子吸收光譜的吸收峰位置紅移，強(qiáng)度減小。因?yàn)椴迦肱潴w與DNA堿基對(duì)可發(fā)生π電子堆積作用，配體的π×空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，使能級(jí)下降導(dǎo)致π→π×躍遷能減小，繼而產(chǎn)生紅移。同時(shí)，偶合后的π×軌道因部分填充電子，使π→π×躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)。紅移的程度和減色效應(yīng)均能反映出插入能力的大小。

槲皮素和配合物1、2、3在加入DNA后紫外光譜如圖2所示。槲皮素在290 nm和325 nm處有2個(gè)吸收峰，吸收峰隨著DNA不斷加入，強(qiáng)度降低，325 nm處發(fā)生紅移；配合物1、2在325 nm處具有較弱的吸收峰，加入DNA后，吸收峰的強(qiáng)度小幅度減小，但未見明顯紅移；配合物3的紫外吸收譜圖沒有明顯的紫外吸收峰，主要原因是，配合物中的槲皮素受到多個(gè)銅離子的影響，使苯環(huán)共軛效果減弱，因此紫外吸收峰不明顯，但是在加入DNA后紫外吸收有降低趨勢(shì)。綜合上述情況，槲皮素是以插入方式與DNA作用；配合物與DNA的作用方式不是明顯的插入方式，可以是插入、靜電和剪切作用多種形式與DNA共同作用，進(jìn)而對(duì)DNA產(chǎn)生裂解效果。

圖2 槲皮素及配合物1、2、3加入DNA后紫外光譜的變化

2.2 裂解作用結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用凝膠電泳法，對(duì)槲皮素及配合物1、2、3對(duì)pBR322 DNA的裂解能力做了初步研究。pBR322 DNA為超螺旋DNA，配合物在以插入方式與超螺旋質(zhì)粒DNA發(fā)生作用后，會(huì)引起DNA閉環(huán)超螺旋的解旋，變成開環(huán)缺刻型，使DNA的遷移率減小，直到超螺旋消失。配合物以靜電或溝區(qū)結(jié)合不會(huì)引起超螺旋的解旋。因此，解旋度是用作插入鍵合方式的證據(jù)之一，同時(shí)，DNA的解旋強(qiáng)度也反應(yīng)配合物對(duì)DNA的裂解能力。

實(shí)驗(yàn)首先檢驗(yàn)反應(yīng)原料和產(chǎn)物的DNA裂解能力。如圖3所示，在反應(yīng)2 h后，槲皮素、新戊酸銅、苯甲酸銅3種原料未能對(duì)pBR322 DNA進(jìn)行裂解，DNA保持Form Ⅰ形態(tài)；而配合物1、2、3在1.5 μg/mL時(shí)，具有明顯的作用，有Form Ⅱ的DNA形成。在對(duì)配合物1、2、3的裂解作用研究中，實(shí)驗(yàn)使用梯度樣品濃度，作用于DNA。結(jié)果如圖4所示，3個(gè)配合物對(duì)DNA的裂解作用呈現(xiàn)濃度依賴。經(jīng)過2 h的作用，在低濃度時(shí)，僅有部分裂解；在質(zhì)量濃度達(dá)到1.88 μg/μL時(shí)，大部分DNA裂解。實(shí)驗(yàn)還表明，在同一濃度下，作用時(shí)間越長(zhǎng)，裂解的越多。

圖3 化合物對(duì)pBR322 DNA裂解能力

3 結(jié)論

本文研究了新型多核銅槲皮素配合物與DNA作用形式和對(duì)DNA的裂解作用。紫外光譜法和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，配合物對(duì)DNA作用效果強(qiáng)于單體槲皮素。配合物通過插入、靜電、剪切多種形式與DNA作用，使其具有高效的DNA斷裂活性，在質(zhì)量濃度為1.88 μg/μL時(shí)，作用2 h，基本全部裂解。

圖4 配合物1、2、3在不同濃度不對(duì)pBR322 DNA的裂解能力