艾祥發(fā) 王海英

遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（貴州遵義563000）

肝肺綜合征（HPS）是源于肝源性疾病晚期引起的以動脈氧合不足引起缺氧為特征的肺內(nèi)出現(xiàn)的并發(fā)癥［1］。病理的血管新生可以導致肺內(nèi)通氣/血流比值失衡和異常分流，從而加重肺部氣體交換異常導致低氧血癥，這是HPS的重要發(fā)生機制。本課題組前期研究已證實促血管生成因子參與病理性血管新生在HPS發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用［2］。已有研究認為異常的血管新生是由于內(nèi)皮細胞間連接松動，內(nèi)皮細胞再次增殖和遷移所導致［3］。

絲氨酸蛋白酶抑制劑B1（SerpinB1）是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，主要作用是保護組織細胞不受應激期間細胞質中的蛋白酶的損傷［4］。已有研究報道該蛋白在炎癥中發(fā)揮作用，大量表達于炎癥細胞，參與了肺部炎癥的發(fā)生機制［5］。對潰瘍性結腸炎患者的研究顯示SerpinB1的表達不僅定位于炎癥浸潤細胞，而且也在結腸上皮細胞有表達［6］。另有研究報道SerpinB1在侵襲性口腔鱗狀細胞癌中過表達并可促進口腔癌細胞遷移［7］。但SerpinB1在肺微血管內(nèi)皮細胞是否表達及其變化以及與血管新生的關系仍未見報道。MAPK通路參與多種細胞增殖、分化的調控，最新研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1通過激活ERK1/2及相關通路減輕自體肝移植后肺部炎癥及氧化應激，減輕肺組織細胞凋亡［8］。本研究旨在探究SerpinB1參與調節(jié)肝肺綜合征血管新生及其機制，為探討通過抑制血管的生成來改善HPS的方法提供科研基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材小鼠抗GAPDH單克隆IgG、TRNzol總RNA提取試劑、蘇木精、SDS?PAGE配膠試劑以購買于康為世紀公司（中國），蛋白酶抑制劑Cocktail購買于羅氏生物公司（美國），ECL發(fā)光液購買于重慶葆光生物有限公司，兔抗Erk1/2抗體、兔抗p?Erk1/2抗體購買于美國R&D公司，山羊抗SerpinB1抗體和小鼠抗CD34抗體購買于Peprotech（美國）公司，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、驢抗山羊IgG購買自碧云天（中國）公司，逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR盒從日本TaKaRa公司購買，PCR引物購買自賽默飛世爾科技（美國）公司。臺式高速離心機購買自ThermoFisher公司，電泳儀購買自Bio?Rad公司。

1.2 實驗動物及動物模型建立健康的SD大鼠40只，3～5月齡，雄性，重量為0.24～0.27 kg，使用抽簽法將這些實驗鼠分類為四組（n=10）：即假手術組（sham），膽總管結扎后1周組（1 W），膽總管結扎后3周組（3 W），膽總管結扎后5周組（5 W）。膽總管結扎組大鼠（CBDL組）用絲線分別結扎膽總管的近十二指腸端和近肝門端，并將游離膽總管剪斷。Sham組即僅打開腹腔并暴露后縫合，不予結扎膽管；膽總管結扎后1周組、3周組、5周組分別于膽總管結扎后1、3、5周通過腹主動脈采血后取肺組織。血氣指標PaO2＜85 mmHg且A?aDO2＞18 mmHg為HPS動物實驗模型制作良好的指標。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色觀察肺組織形態(tài)學改變肺組織用4%多聚甲醛固定12 h后進行石蠟包埋，切片厚約5 mm，行HE染色后在光鏡下（200×）隨機選十個視區(qū)觀測肺組織及微血管病變。

1.3.2 免疫組化觀察目的蛋白表達分布石蠟切片放置于60℃烤箱烘烤2 h后，將片子放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中1 h除石蠟、然后在濃度梯度酒精中脫水10 min/次；滴加 3%的 H2O2封片 40 min，高壓鍋抗原修復5 min后冷卻至室溫。山羊血清封片1 h，去掉血清滴加一抗（一抗稀釋比例分別為SerpinB1 1∶200，Erk 1∶300，p?Erk 1∶300，CD34 1∶300），并放置于濕盒中4℃過夜后用PBS洗滌2～3次；滴加二抗工作液放在37℃溫箱中1 h，PBS緩沖液進行充分洗滌；滴加DAB顯色液于顯微鏡下觀察著色后充分沖洗；蘇木精染色10 s后沖洗；按照75%乙醇→二甲苯I的順序脫水并封片，最后對制作好的切片進行觀察和拍照。從每個組化切片挑選至少五個視野，并通過Image Proplus和累積光密度值（IOD）指標對表達量進行量化。

1.3.3 微血管密度（MVD）的評估選擇抗CD34的一抗并使用免疫組化的方法標記各組肺組織CD34陽性細胞，在高倍鏡（200×）下觀察計數(shù)，并將CD34陽性細胞數(shù)所占比作為微血管密度。每個肺組織切片至少選取5個視野，并用NIS?Elements AR軟件計數(shù)CD34陽性細胞，統(tǒng)計CD34陽性細胞的比例，算出微血管密度。

1.3.4 qRT?PCR實驗按TRNzol RNA試劑說明書操作步驟獲取肺組織中總的RNA；用分光光度計檢測提取RNA的濃度，按相關說明使用TaKaRa反轉錄試劑盒和T100反轉錄儀器將RNA反轉錄為cDNA，按說明書操作用特異引物將cDNA片段擴增，熒光定量PCR系統(tǒng)檢測目的基因的Ct值，以內(nèi)參選取GAPDH，并算出相對表達量。

1.3.5 Western blot實驗將肺組織用研缽磨碎后，滴加約800 μL的RIPA裂解液及Cocktail蛋白酶抑制劑（100×）提取組織蛋白，用BCA法檢測樣品蛋白濃度。制備10%SDS聚丙烯胺凝膠，每孔上樣量為60 μg，70 V/90 V電泳結束后轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗于濕盒中4℃冰箱進行孵育（SerpinB1 1∶800，GAPDH 1∶2 000）過夜，然后用TBST對膜進行清洗；二抗（1∶3 000）室溫孵育100 min，TBST清洗膜8 min×4次，滴加ECL發(fā)光試劑進行顯影，各組實驗重復3次。結果用Image Lab軟件進行灰度值測量，用目的蛋白灰度值除以GAPDH灰度值得到相對值用于統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學方法本實驗選擇SPSS 19.0，計量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差展示，多個組之間相比選用單個因素方差分析，兩個組之間對比均數(shù)使用t檢驗，組間相關性分析用相關系數(shù)r分析比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CBDL大鼠肺組織大體觀察及血氣分析結果肺組織大體可見sham組大鼠肺色澤紅潤，無出血點，無組織病變和壞死（圖1A）；CBDL 1周組大鼠可見少量點狀病變（圖1B）；CBDL 3W組大鼠肺組織色澤暗淡，出現(xiàn)較多點狀病變和部分融合病變（圖1C）；CBDL 5周組大鼠肺組織色澤暗淡，可見大量點狀病變和較多融合病灶，伴有肺組織壞死（圖1D）。

血氣分析結果表明與Sham組大鼠比較，CBDL組大鼠氧分壓降低而肺泡-動脈血氧分壓差升高，在CBDL 3周及CBDL 5周時以上變化有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）其中 CBDL 5WA?aDO2增大最明顯（P＜0.01）見表2。

圖1 各組大鼠肺組織大體外觀Fig.1 Appearance of lung tissue in each group

表2 各個組大鼠之間血氣數(shù)值比較（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

表2 各個組大鼠之間血氣數(shù)值比較（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

注：與Sham組比較，*P＜0.05

指標PaO2 A?aDO2 Sham組96.2±2.4 8.0±1.5 1周組89.7±3.0 13.2±1.4 3周組80.0±1.7*20.1±0.9*5周組75.6±1.2*22.7±0.7*

2.2 CBDL大鼠肺組織HE染色及形態(tài)觀察HE染色可觀察到，Sham組大鼠肺組織結構相對完整，細胞胞質豐富，胞核染色均勻（圖2A）。與Sham相比，CBDL 1周組大鼠肺部有較多炎癥細胞浸潤，肺泡結構出現(xiàn)紊亂（圖2B）；CBDL 3周組大鼠肺泡結構嚴重紊亂被破壞，血管腔擴大明顯且管腔內(nèi)炎性細胞增多（圖2C）；CBDL 5周組肺組織炎癥細胞浸潤明顯，血管官腔直徑增寬，組織結構被破壞且肺泡間隔明顯增厚（圖2D）。通過對多個切片樣本進行觀察后發(fā)現(xiàn)肺泡微血管直徑在CBDL大鼠模型中有所擴張（圖2E）。

2.3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在各組大鼠肺組織中mRNA水平的表達通過qRT?PCR定量結果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較SerpinB1、Erk1/2、CD34在CBDL組均表達上調（P＜0.01）；其中在1W肺組織mRNA水平表達量高于Sham組（P＜0.01），在3W肺組織mRNA水平表達量高于1周組（P＜0.01），在5周肺組織mRNA水平表達量高于3周組（P＜0.01，圖3）。

2.4 SerpinB1及Erk1/2在各組大鼠肺組織中蛋白水平的表達Western blot實驗證實SerpinB1在CBDL組相比Sham組均有表達上調（P＜0.01，圖4），表明CBDL大鼠模型中SerpinB1可能參與了HPS疾病進展。同時免疫印跡法檢測到Erk1/2及p?Erk1/2的表達上調（P＜ 0.01，圖4），并且Erk1/2表達升高（P＜0.01）與SerpinB1的變化具有相關性（r=0.884，P＜0.05）。表明SerpinB1可能通過調控Erk1/2參與到肝肺綜合征的發(fā)病機制中。

圖2 大鼠肺組織HE切片觀察（HE 200×）Fig.2 HE sections of rat lung tissue（HE 200 ×）

圖3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在大鼠肺組織中mRNA表達Fig.3 mRNA expression of SerpinB1,Erk1/2 and CD34 in rat lung tissue

圖4 免疫印跡法檢測SerpinB1及Erk1/2在肺中的表達情況及統(tǒng)計Fig.4 Immunoblotting assay for the expression of SerpinB1 and Erk1/2 in the lung tissue and statistics

2.5 SerpinB1在CBDL大鼠肺中的分布及表達情況進一步通過肺組織切片免疫組化染色結果可見，SerpinB1主要表達于微血管內(nèi)皮細胞、炎癥細胞以及部分肺泡上皮細胞，SerpinB1在CBDL組表達相對于Sham組明顯增加（P＜0.01），并且表達量隨著CBDL建模周數(shù)的增加逐漸遞增。表現(xiàn)為SerpinB1在CBDL 3周組表達量高于CBDL 1周（P＜0.01），CBDL 5周組表達量高于CBDL 3周組（P＜ 0.01，圖5A?E）。

2.6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺組織中的表達分布染色結果表明Erk1/2，p?Erk1/2以及CD34主要表達于微血管內(nèi)皮細胞，并且在CBDL 3W組的表達高于Sham組（P＜0.01）。與Sham組相比較，CBDL 3周組大鼠肺組織中p?Erk/Erk的表達量有所上調（P＜0.01），CBDL 3周組CD34的表達也顯著升高。用CD34陽性細胞百分比作為肺組織微血管密度（MVD）的指標，評估發(fā)現(xiàn)CBDL 3周組大鼠肺組織微血管密度顯著增加，并且與SerpinB1上調呈正相關（r=0.795，P＜ 0.05）（圖6A，B）。

3 討論

嚴重的慢性肝病的發(fā)生主要由肝細胞功能衰竭和門脈高壓作用引起，其中約有15%～30%發(fā)生與原發(fā)肺部病變無關的肺部并發(fā)癥，即HPS；HPS的存在損害患者的生活質量并增加了患者的病死率，需要肝移植治療才可逆轉［9-10］?，F(xiàn)有研究認為HPS患者發(fā)生難以糾正的低氧血癥的發(fā)生機制主要包括：肺泡通氣-血流灌注失調、肺泡內(nèi)氣體彌散障礙以及動靜脈分流［11］；這些病理改變主要與肝功能受損引起肺部微血管異常擴張［12］，腸道細菌的異常轉移［13］，肺內(nèi)單核-巨噬細胞活化并釋放炎癥因子［14］，以及血管新生增強也是實驗性HPS發(fā)生的重要因素［15］。

圖5 免疫組化法檢測大鼠肺組織中SerpinB1表達情況（200 ×）Fig.5 Detection of SerpinB1 expression in rat lung tissue by immunohistochemistry（200 ×）

SerpinB1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑這一家族中的成員，Serpin家族參與多種生化反應，包括調節(jié)凝血（血栓形成和溶栓），神經(jīng)營養(yǎng)因子，激素轉運，補體和炎癥，激素轉運，血管生成和血壓等［16］。已有報道 PAI?1（SerppinE1）［17］、Maspin（SerpinB5）［18］、SerpinB3及SerpinB13等均與血管新生有關系，其中Maspin（SerpinB5）在腫瘤中的效應表現(xiàn)為抗腫瘤血管新生、抑制遷移和浸潤，其與整合素β1的活化密切相關［18］。以往的研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1在急性肺損傷中通過激活Erk1/2通路改善急性氧化應激和減輕內(nèi)皮細胞凋亡從而起到保護作用［8］，這表明SerpinB1在內(nèi)皮細胞的增殖過程中扮演關鍵角色。本研究結果發(fā)現(xiàn)HPS組大鼠血氣分析結果PaO2降低且A?aDO2升高（表2），HE染色結果表明HPS大鼠肺組織結構被破壞及肺間隔增厚（圖2），進一步研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1的mRNA水平及蛋白表達水平均上調（圖3、圖4），通過免疫組化發(fā)現(xiàn)主要分布于微血管內(nèi)皮細胞和炎癥細胞（圖5），提示SerpinB1在HPS的發(fā)生機制中可起到重要作用。

圖6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺組織中的表達分布Fig.6 Distribution and expression of Erk1/2 and CD34 in lung tissue of CBDL rats

內(nèi)皮細胞生長和增殖對于血管生成是關鍵的［19］，實驗組前期研究已證實Erk1/2在實驗性HPS中對血管新生的重要性［20］。本研究通過免疫印跡實驗檢測到HPS組大鼠Erk1/2蛋白水平的上調并且與SerpinB1的表達具有相關性（r=0.884，P＜0.05）。CD34是微血管內(nèi)皮細胞重要的標志物，CD34陽性比例可表示血管新增數(shù)量，本實驗證實CD34陽性細胞數(shù)在HPS大鼠中的表達較Sham組明顯增高并且并且與SerpinB1上調呈正相關（r=0.795，P＜0.05），這表明SerpinB1可能參與到內(nèi)皮細胞增殖及血管新生的調控，并且可能與激活Erk1/2，促進Erk1/2磷酸化有密切關系。

綜上所訴，通過調控SerpinB1的表達水平來從而抑制內(nèi)皮細胞的增殖，可以有效抑制HPS患者肺血管新生，從而改善肺內(nèi)分流和缺氧狀態(tài)。本實驗將SerpinB1及Erk1/2與肺血管新生聯(lián)系在一起進行研究，提出一種可能存在的調控途徑，為肝肺綜合征的治療提供新靶點。但本研究僅局限于CBDL模型體內(nèi)研究SerpinB1的表達變化及其與Erk1/2的關系，尚未進行干擾SerpinB1表達后的觀察，尚未在內(nèi)皮細胞水平進一步證實。下一步深入研究需要在細胞水平進行干擾后并觀察其對內(nèi)皮細胞增值遷移能力的影響。