◎ 陳光申

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

啤酒是世界上消費量最大的酒類飲料，全球啤酒產(chǎn)量連續(xù)多年保持增長；啤酒作為一種含二氧化碳的、起泡的、低酒精度發(fā)酵酒，在全球倍受歡迎。目前，我國是世界上最大的飲料酒生產(chǎn)和消費國，酒類品種繁多，釀造歷史悠久，是世界上產(chǎn)業(yè)規(guī)模最大的國家之一[1]。中國是全球啤酒市場中人均消費量增長最快的國家。2002年，中國啤酒總產(chǎn)量達(dá)2 386.83萬t，位居世界第一，并連續(xù)16年蟬聯(lián)。2013年，中國啤酒企業(yè)年總產(chǎn)量為5 061.54萬t，同比增長4.59%[2]。隨著啤酒行業(yè)的發(fā)展,消費者對啤酒質(zhì)量的要求提高，在制作與銷售過程中的啤酒質(zhì)量控制極為關(guān)鍵，作為食品監(jiān)測中的一項，對啤酒微生物進(jìn)行檢查與分析具有重要意義。

1 材料與方法[3-5]

1.1 材料

成品熟?。ㄊ袌鲈谑燮【齐S機取樣）、無菌培養(yǎng)皿（Φ90 mm）、無菌吸管（1 mL、10 mL）、無菌生理鹽水、無菌試管、酒精燈、開瓶器、無菌紗布、無菌三角瓶、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基以及煌綠乳糖膽鹽（BGLB）,雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），1 mol·L-1NaOH，1 mol·L-1HCl，單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），pH試紙，接種環(huán)，超凈工作臺及電爐（微波爐）等。

1.2 樣品的采取與預(yù)處理

瓶裝啤酒采用原包裝樣品，取原包裝兩瓶；用滅菌容器采取500 mL散裝樣品，放入滅菌磨口瓶中。

在對啤酒取樣時，將瓶蓋部分浸入75%的乙醇1 min后用火灼燒，用石炭酸紗布蓋好，再用滅菌開瓶器啟開，由于啤酒含二氧化碳，可倒500 mL滅菌磨口瓶中，口勿蓋緊；覆蓋滅菌布，輕輕搖蕩5 min，待氣體全部逸出后，進(jìn)行檢驗。散裝酒類，可直接吸取檢驗。

使用無菌1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)樣品酒pH至6.5～7.5。

1.3 菌落總數(shù)的測定

啤酒中菌落總數(shù)測定常用有2種測定方法：平板菌落計數(shù)法和菌落總數(shù)PetrifilmTM。

①測試片法。平板菌落計數(shù)是將啤酒經(jīng)過一系列處理后進(jìn)行計數(shù)。②菌落總數(shù)PetrifilmTM法則是將啤酒樣液滴入含有培養(yǎng)基和指示劑的紙片上進(jìn)行培養(yǎng)，紙片大多是滅菌濾紙、纖維膜、膠膜等，不同的培養(yǎng)基配置原料、方法、消毒滅菌過程等會影響PetrifilmTM的效果。

1.3.1 樣品的稀釋

①采用無菌操作吸取25 mL預(yù)處理后的啤酒樣品，放置于裝有225 mL無菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內(nèi)，振蕩，混合成1∶10的均勻樣品稀釋液。②無菌操作吸取1 mL 1∶10稀釋液，注入含有9 mL無菌生理鹽水的無菌試管內(nèi)，振蕩，混合成1∶100的均勻樣品稀釋液。③同上，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸管。

1.3.2 樣品的處理

取稀釋后的樣品均液和空白稀釋液（不含啤酒樣品的無菌生理鹽水）各1 mL，注入無菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。配制好的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）冷卻到46 ℃后，注入平皿中約15 mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻?？瞻紫♂屢旱臒o菌平皿做空白對照。

為使菌落均勻的分布在平板上，均勻樣品稀釋液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并且旋轉(zhuǎn)混合均勻，可以正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20 min，以防止細(xì)菌死亡或繁殖。

1.3.3 培養(yǎng)

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，將其放置在（36±1）℃條件下培養(yǎng)（48±2）h。

1.3.4 菌落計數(shù)

培養(yǎng)規(guī)定時間后，立即計數(shù)。可以用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器檢查，以防止遺漏。記錄各平板的菌落總數(shù)，求出菌落總數(shù)。

1.3.5 菌落總數(shù)的計算方法

（1）若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)（30～300 CFU），計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。

（2）若有兩個連續(xù)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：

式（1）中：N—樣品中菌落數(shù)；∑C—平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1—第一個適宜稀釋度的平板數(shù)；n2—第二個適宜稀釋度的平板數(shù)；d—稀釋因子（第一稀釋度）。

1.3.6 結(jié)果報告

若空白平皿中沒有菌落，并且兩個平行平皿中菌落數(shù)相近，則菌落總數(shù)為兩平皿中的菌落平均數(shù)；若空白平皿中有菌落或兩平行平皿中的菌落總數(shù)相差太大，則該實驗需要重做。

1.4 大腸菌群的測定

1.4.1 樣品的稀釋

同1.3.1，但從制備樣品均液至樣品接種完畢全程應(yīng)15 min內(nèi)。

1.4.2 初發(fā)酵與復(fù)發(fā)酵試驗

第一步是初發(fā)酵，培養(yǎng)基是月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）。每個樣品需接種9個裝有小倒管的培養(yǎng)基試管。其中3個試管是雙料管，其余6個是單料管。取10 mL預(yù)處理樣品接種在3個雙料管和單料管中。經(jīng)過（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h后，觀察發(fā)酵管中的小倒管中是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至（48±2）h，記錄24 h和48 h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。都未產(chǎn)氣者，可直接判定該樣品的大腸菌群為陰性。產(chǎn)氣者需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵。其操作是：用接種環(huán)從所有（48±2）h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基（BGLB）復(fù)發(fā)酵管中，再經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。

1.4.3 大腸桿菌計數(shù)

初發(fā)酵未產(chǎn)氣者，可直接判定為大腸桿菌陰性，復(fù)發(fā)酵產(chǎn)氣者，計為大腸桿菌陽性，根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)和接種量，查大腸菌群檢索MPN表，報告每克（或毫升）該樣品中大腸菌群的MPN值。

2 結(jié)果與分析

啤酒的微生物部分衛(wèi)生要求[6]如表1。

表1 啤酒的微生物要求表

其中，菌落總數(shù)指的是啤酒經(jīng)過處理，1 mL啤酒在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上在（36±1）℃條件下培養(yǎng)（48±2）h后，生長出來的微生物菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以用這一方法觀察細(xì)菌在啤酒中繁殖的動態(tài)，以便對啤酒樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。

本檢測中的大腸桿菌指在（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群的數(shù)量以每100 mL啤酒中最可能數(shù)來表示。

由于大腸菌群直接或間接來源于人以及溫血動物的糞便。大腸菌群在啤酒的衛(wèi)生檢查中有2方面的意義。①受糞便污染的指標(biāo)菌。用來衡量啤酒生產(chǎn)過程中的操作衛(wèi)生狀況。②可作為腸道致病菌污染啤酒的指示菌。大腸菌群數(shù)量越大，啤酒中腸道致病菌存在的可能性越大。

對啤酒樣品菌落總數(shù)重復(fù)測定10次，并對每個樣品做兩個平行測定，菌落總數(shù)、大腸桿菌測定結(jié)果如表2、表3。

表2 樣品中菌落測定結(jié)果表

表3 大腸桿菌測定結(jié)果表

對比國家標(biāo)準(zhǔn)可以看出，該批次啤酒樣品微生物衛(wèi)生檢查結(jié)果為合格。

3 討論

啤酒作為人們社會生活中主要的酒類消費品之一，其質(zhì)量與安全不僅影響著生產(chǎn)企業(yè)的利益，更關(guān)乎消費者的身體健康。就要求啤酒生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)對啤酒進(jìn)行微生物衛(wèi)生檢查；在生產(chǎn)過程中，要有明確的衛(wèi)生控制與詳細(xì)的微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)?？傊?，只有徹底消除啤酒中有害微生物或?qū)⒂泻ξ⑸飻?shù)量控制在一定范圍內(nèi)，才能生產(chǎn)出高質(zhì)量的、符合消費者需求的、產(chǎn)品穩(wěn)定性強的啤酒。因此，對啤酒中微生物的檢測與分析，具有十分重要的意義。