馬 喆，方臻臻，吳煥淦，顧沐恩，楊 玲，祁 琴，汪 迪，李昆珊，劉慧榮，黃 艷＊＊，陸 嫄＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437）

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎性疾病，與克羅恩?。–rohn's disease，CD）同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的范疇，病變部位主要局限于大腸黏膜與黏膜下層，范圍多累及遠(yuǎn)端結(jié)腸，并可向近端逆行發(fā)展，甚至累及全結(jié)腸。臨床流行病學(xué)資料表明該病的高發(fā)地區(qū)主要集中在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，中國(guó)在內(nèi)的多數(shù)發(fā)展中國(guó)家為低發(fā)病率地區(qū)，但是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)UC在中國(guó)的發(fā)病呈逐漸上升趨勢(shì)，且南方人群發(fā)病率高于北方人群[1，2]。我國(guó)1956年報(bào)道了第1例UC患者，2006年我國(guó)回顧性分析，UC患病率約為11.6/10萬(wàn)，已經(jīng)成為我國(guó)消化道疾病的主要疾病[3，4]。潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、腹痛及黏液膿血便等癥狀，另外還可表現(xiàn)為皮膚、眼睛、關(guān)節(jié)和肝膽等腸外癥狀[5，6]。本病遷延不愈，有發(fā)生癌變的可能，加重了患者在診療過(guò)程中的心理負(fù)擔(dān)。因此，深入研究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制，并尋找有效的治療方法已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，UC的病理機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，在UC的整個(gè)病理過(guò)程中，腸黏膜屏障作為腸道的重要防線之一，與UC的發(fā)病密切相關(guān)[7，8]。腸黏膜屏障損傷引起的腸黏膜屏障通透性的增加可能是UC發(fā)病的始動(dòng)因素，由此引發(fā)的腸道對(duì)細(xì)菌、毒素等的吸收增加、機(jī)體異常免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，是UC病情進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)[9，10]。因此，保護(hù)腸黏膜屏障的完整性可能在一定程度上能夠抑制UC的病理進(jìn)程，并可作為改善UC臨床癥狀的潛在治療方法之一。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

“艾灸預(yù)處理”即用灸法防病保健，其理論基礎(chǔ)是通過(guò)艾灸來(lái)疏通經(jīng)絡(luò)氣血，激發(fā)人體的正氣，以增加機(jī)體抵御外邪、預(yù)防或治療疾病的能力，并可在一定程度上減緩各種因素對(duì)機(jī)體造成的惡性應(yīng)激，是針灸“治未病”的主要預(yù)處理方法之一[11-14]。相對(duì)于針刺治療疾病時(shí)對(duì)“既病防變”的環(huán)節(jié)的側(cè)重，艾灸更加側(cè)重于“未病先防”，適宜于疾病的預(yù)防[15-18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸預(yù)處理“天樞”穴，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮艾灸保健與養(yǎng)生的作用[19]，因此本研究基于前期的研究基礎(chǔ)，探討艾灸預(yù)處理對(duì)UC腸黏膜屏障保護(hù)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

近交系雄性Sprague Dawley（SD）清潔級(jí)大鼠28只，體重180±20 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002；飼養(yǎng)環(huán)境：12小時(shí)晝夜節(jié)律交替、室溫20±2℃，室內(nèi)濕度50%-70%。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法，分成正常組、模型組、隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組，每組7只。所有實(shí)驗(yàn)操作均在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 藥物和試劑

DSS（公司：MPBiomedicals，分子量：36000-50000，貨號(hào)：9011-18-1，規(guī)格：500GM）；艾條、艾絨：南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司；藥粉：附子（四川）、肉桂（廣西）、木香（云南）等；黃酒：上海慶豐釀造調(diào)味品有限公司。一抗 NF-κb P65（公司：CST，濃度 1∶1000，貨號(hào)：8242）；IL-1β（公司：abcam，濃度：1∶500，貨號(hào)：ab9722）；Occludin（公司∶abcam，濃度：1∶400，貨號(hào)：ab167161）；JAM1（公司∶abcam，濃度：1∶100，貨號(hào)：ab180821）；ZO-1（公司∶abcam，濃度：1∶200，貨號(hào)：ab190085）MUC2（公司：abcam，即 用 型，貨號(hào)：ab76775）；蘇木素：南京建成科技有限公司；伊紅：南京建成科技有限公司；鼠兔通用免疫組化試劑盒：上海威奧生物科技有限公司；封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液：上海威奧生物科技有限公司。

1.3 造模及干預(yù)方法

艾灸干預(yù)（第1-7天）：隔藥灸預(yù)處理組行隔藥灸干預(yù)，將藥餅（直徑1 cm、厚度0.5 cm）置于大鼠天樞穴區(qū)，上置艾炷（90 mg）施灸，每日1次，每次每穴灸2壯，連續(xù)灸7天；溫和灸預(yù)處理組行溫和灸干預(yù)，采用大鼠實(shí)驗(yàn)專用艾條（直徑7 mm、長(zhǎng)120 mm，重2 g）距離天樞穴2 cm處施灸，溫和灸過(guò)程中每間隔兩分鐘刮取艾灰一次，每日1次，每次每穴灸10 min，連續(xù)灸7天；正常組、模型組不予干預(yù)，只做與艾灸預(yù)處理組相同的抓取與固定；穴位定位參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007年版）；

模型制備（第8-14天）：隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組、模型組予4%DSS水溶液連續(xù)飲用；正常組不予干預(yù)。

1.4 大鼠一般情況觀察

觀察各組大鼠的飲食量、飲水量、精神狀況、皮毛光澤度、大便性狀等大體情況。

1.5 標(biāo)本的采集和處理

采用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30-40 mg?kg-1）。自恥骨聯(lián)合處-盲腸取下結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開(kāi)結(jié)腸，予生理鹽水沖洗后，觀察大鼠結(jié)腸大體情況，自下而上取6-8 cm結(jié)腸段，并截取其中的一段（1 cm）固定于4%多聚甲醛固定液中用于形態(tài)學(xué)觀察，剩余部分剪碎混合后平均分成2份，置于液氮1小時(shí)后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 HE染色

切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min；下行梯度酒精：100%、95%、90%、80%、70%乙醇各5 min；雙蒸水5 min×2次；蘇木素浸染2-3 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化1-2 s，流水沖洗5 min，伊紅浸染2-3 min；上行梯度酒精：70%、80%、90%、100%乙醇各1-2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min；封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)變化并評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Obermeier F等制定的標(biāo)準(zhǔn)[20]。

圖2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察及評(píng)分

1.7 免疫組化檢測(cè)法

取大鼠結(jié)腸組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后于37℃條件下滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜并于第2天滴加二抗孵育。PBS沖洗后用DAB顯色液進(jìn)行顯色。之后用蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色1 min，脫水，封片。在顯微鏡下隨機(jī)選擇3-5個(gè)視野觀察，以胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕褐色顆粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片在固定光亮度下，隨機(jī)選取3-5個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image-PlusPro 6.0軟件分析，計(jì)算出每張照片的陽(yáng)性目標(biāo)陽(yáng)性面積(Area)和積分光密度(IOD)，求出陽(yáng)性目標(biāo)的平均光密度(AOD)(AOD=IOD/Area)，最后取平均值即為該切片的陽(yáng)性目標(biāo)平均光密度值。

1.8 免疫印跡檢測(cè)法

取大鼠結(jié)腸組織，剪碎，加入RIPA裂解液，充分提取蛋白后離心取上清；采用BCA蛋白定量法測(cè)定各樣本蛋白濃度，調(diào)整各樣本濃度一致變性后，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜后加入封閉液(5%脫脂奶粉)中室溫封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)一抗于脫色搖床上4℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗孵育1 h，最后于暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料先作正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法，若方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3法；不符合正態(tài)性分布者以中位數(shù)（四分位數(shù)）[Median(P25，P75)]表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。所有檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾灸預(yù)處理對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織炎癥的效應(yīng)觀察

2.1.1 大鼠一般情況變化

艾灸干預(yù)（第1-7天）期間：各組大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，飲食和飲水量正常，毛發(fā)干凈有光澤，肛周無(wú)污穢，糞便軟硬適中，飼養(yǎng)籠墊料干燥。

模型制備（第8-14天）期間：正常組大鼠無(wú)異常變化；模型組大鼠在飲用DSS水溶液2天之后開(kāi)始出現(xiàn)喜靜少動(dòng)、精神萎靡癥狀，飲食和飲水量較正常組有所減少，肛周污穢，糞便不成形、甚有便血，飼養(yǎng)籠墊料易污穢，且上述一般情況的嚴(yán)重程度隨著飲用DSS天數(shù)的增加逐漸加重；隔藥灸預(yù)處理組和溫和灸預(yù)處理組大鼠一般情況較模型組比較，出現(xiàn)的時(shí)間稍有延遲，且程度較輕。

2.1.2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

光鏡下觀察各組結(jié)腸組織HE染色結(jié)果，正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，上皮組織完整，腺體排列整齊，可見(jiàn)大量的杯狀細(xì)胞，黏膜固有層可見(jiàn)毛細(xì)血管和少量散在的淋巴細(xì)胞，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)充血、水腫；模型組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)不清，上皮脫落，腺體破壞，可見(jiàn)大面積潰瘍，杯狀細(xì)胞基本消失，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有充血、水腫；隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較為清晰，上皮較為完整，腺體排列較規(guī)則，可見(jiàn)小面積潰瘍，杯狀細(xì)胞部分消失，黏膜及黏膜下層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有輕度充血、水腫（圖2）。

圖3 大鼠結(jié)腸組織Occludin蛋白表達(dá)

圖4 大鼠結(jié)腸組織JAM1蛋白表達(dá)

2.2 艾灸預(yù)處理對(duì)UC大鼠腸黏膜屏障的作用機(jī)制研究

2.2.1 各組大鼠結(jié)腸組織Occludin免疫組化結(jié)果

Occludin蛋白主要表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中。正常組Occludin蛋白大量表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量Occludin蛋白表達(dá)于上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中；隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織Occludin蛋白在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)；采用平均光密度（IOD/AREA）定量結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織Occludin的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織Occludin的表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜ 0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖3）。

2.2.2 各組大鼠結(jié)腸組織JAM1免疫組化結(jié)果

JAM1蛋白連續(xù)表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中。正常組JAM1蛋白大量表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量JAM1蛋白表達(dá)于上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中；隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織JAM1蛋白在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。采用平均光密度（IOD/AREA）定量結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織JAM1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織JAM1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜ 0.05）（圖4）。

圖5 大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)

圖6 大鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)

2.2.3 各組大鼠結(jié)腸組織MUC2免疫組化結(jié)果

MUC2蛋白表達(dá)于結(jié)腸黏膜隱窩的杯狀細(xì)胞內(nèi)和少量上皮細(xì)胞內(nèi)。正常組MUC2蛋白大量表達(dá)于結(jié)腸黏膜隱窩的杯狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞內(nèi)，染色陽(yáng)性結(jié)果呈棕褐色；模型組、隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白染色強(qiáng)度均有不同程度減弱。采用平均光密度（IOD/AREA）定量結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖5）。

2.2.4 各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1免疫組化結(jié)果

ZO-1蛋白主要表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中。正常組ZO-1蛋白大量表達(dá)在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞的胞漿中，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量ZO-1蛋白表達(dá)于上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中；隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白在上皮細(xì)胞和腺體腺上皮細(xì)胞胞漿中有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)；采用平均光密度（IOD/AREA）定量結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖6）。

2.3 艾灸預(yù)處理對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制

2.3.1 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB P65蛋白表達(dá)

圖7 大鼠結(jié)腸組織NF-κB P65蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.01）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜0.01）（圖7）。

2.3.2 各組大鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預(yù)處理組、溫和灸預(yù)處理組大鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHM+P＜ 0.01，PWM+P＜ 0.001）（圖8）。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛及粘液膿血便等癥狀，病情持久難愈且易反復(fù)，與中醫(yī)學(xué)中“腹瀉”、“便血”、“久瀉”、“久痢”、“腸癖”之證頗為相似。該病發(fā)病率高且愈后差，因此，加強(qiáng)本病的防治能夠在一定程度上節(jié)約醫(yī)療資源和提高患者生活質(zhì)量。中醫(yī)自古就有“治未病”的思想，“艾灸預(yù)處理”就屬于其中的代表，它屬于中醫(yī)學(xué)中“逆灸”的范疇[21]，是一種用灸法預(yù)處理用于保健防病的方法，在中醫(yī)古籍中有大量關(guān)于“逆灸”防病保健的案例與方法，如明·高武在《針灸聚英》里說(shuō):“無(wú)病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也。”這種艾灸療法被現(xiàn)代醫(yī)家和百姓用以養(yǎng)生，既可預(yù)防疾病的發(fā)生又可既病防變[22]。潰瘍性結(jié)腸炎屬于腸腑病，根據(jù)腧穴的近治作用，天樞穴定位在臍中旁二寸，居陰陽(yáng)升降之所，為天地之樞，又為足陽(yáng)明胃經(jīng)穴、大腸募穴，對(duì)于腸道疾病有較好的治療作用[23-25]。

近年來(lái)，艾灸在治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療中取得了顯著的療效，臨床上應(yīng)用艾灸治療潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的優(yōu)勢(shì)[26-28]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究腸黏膜屏障保護(hù)機(jī)制揭示了艾灸治療UC的機(jī)制，其結(jié)果表明艾灸能夠升高腸黏膜屏障相關(guān)蛋白（腸上皮閉鎖蛋白和緊密連接蛋白）的表達(dá)，通過(guò)發(fā)揮促進(jìn)損傷黏膜修復(fù)的作用而達(dá)到抑制結(jié)腸炎的目的[29-31]?；诎闹委烾C的療效優(yōu)勢(shì)和腸黏膜屏障保護(hù)的機(jī)制研究，本研究從艾灸保護(hù)UC腸黏膜屏障的角度出發(fā)，結(jié)合中醫(yī)“治未病”的思想，突出艾灸的“防病”作用，并提出假設(shè)，探討艾灸預(yù)處理是否可通過(guò)加強(qiáng)UC腸黏膜屏障的保護(hù)，以減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)來(lái)防治UC的發(fā)生發(fā)展。

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障、生物屏障四部分構(gòu)成[32]。本研究觀察了腸黏膜機(jī)械屏障中的相關(guān)緊密連接咬合蛋白(Occludin)、連接黏附分子(junction adhesion molecule，JAMs)、閉合小環(huán)蛋白(ZO-1)等3種關(guān)鍵蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組Occludin、JAM1、ZO-1等3種蛋白的表達(dá)量顯著降低。既往研究表明腸黏膜機(jī)械屏障中的緊密連接在腸屏障中起決定性作用，緊密連接的減少或破壞會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障通透性增加，腸腔抗原攝入也隨之增加，并與免疫細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)[33-35]，因此，調(diào)節(jié)和保護(hù)緊密連接蛋白對(duì)于UC的防治具有重要意義。本研究采用艾灸預(yù)處理的方法觀察艾灸對(duì)腸黏膜屏障中緊密連接蛋白的影響作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隔藥灸預(yù)處理對(duì)3種緊密連接蛋白的表達(dá)均有升高作用，溫和灸預(yù)處理也升高了Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)，表明艾灸預(yù)處理對(duì)腸黏膜機(jī)械屏障中相關(guān)緊密連接蛋白具有保護(hù)作用。

腸上皮表面覆蓋的黏液構(gòu)成了腸黏膜的化學(xué)屏障，主要是由腸道杯狀細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞分泌的黏蛋白(mucin，MUC)所組成，在整個(gè)腸黏膜屏障中也起了關(guān)鍵作用[36]。MUC2是參與構(gòu)成腸黏膜屏障最重要的糖蛋白，能夠阻止細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞結(jié)合，使細(xì)菌留在黏液層并在腸蠕動(dòng)時(shí)被有效清除[37，38]。臨床研究表明UC患者腸黏膜MUC2的表達(dá)降低并且與UC病情嚴(yán)重程度相關(guān)[39]。實(shí)驗(yàn)研究也表明在MUC2缺乏的小鼠發(fā)展成了具有UC樣結(jié)腸炎的表現(xiàn)，且腸黏膜滲透性的增加導(dǎo)致TNF-α、IFN-γ等炎癥因子的大量產(chǎn)生[40]。本研究組織病理學(xué)結(jié)果提示模型組大鼠也具有明顯的結(jié)腸炎表現(xiàn)，表現(xiàn)為結(jié)腸上皮伴有缺損，黏膜結(jié)構(gòu)不清，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體破壞，杯狀細(xì)胞減少，潰瘍形成；進(jìn)一步觀察模型組中MUC2的蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)量顯著降低，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)；而在造模前給予隔藥灸預(yù)處理和溫和灸預(yù)處理的大鼠組織病理學(xué)評(píng)分較模型組均明顯降低，MUC2蛋白表達(dá)量也明顯升高，表明艾灸預(yù)處理同樣對(duì)MUC2蛋白具有保護(hù)作用。

研究表明，腸黏膜屏障的破壞可導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎癥因子，炎癥因子又可形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步加重腸道炎癥反應(yīng)[41-43]。我們已經(jīng)證實(shí)了艾灸預(yù)處理對(duì)腸黏膜屏障相關(guān)蛋白的保護(hù)作用，而這種保護(hù)是否能夠形成腸道防線來(lái)減輕或抑制UC的炎癥反應(yīng)呢？因此，我們需要通過(guò)評(píng)估機(jī)體的炎癥反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證腸黏膜屏障的防線作用。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可以與UC密切相關(guān)的細(xì)胞因子如（IL-1β）的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，與UC炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[44]。通過(guò)觀察結(jié)腸組織中NF-κB p65和IL-1β的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，隔藥灸預(yù)處理明顯降低了這兩種蛋白表達(dá)，溫和灸預(yù)處理對(duì)IL-1β的表達(dá)也具有顯著抑制作用，表明艾灸預(yù)處理在一定程度上減輕了UC的炎癥反應(yīng)，這種抑制效應(yīng)可能正是由于腸黏膜屏障發(fā)揮的防線作用來(lái)起效的。

綜上，本研究采用DSS成功模擬了UC模型，其病理組織改變符合UC的典型特征。通過(guò)觀察艾灸預(yù)處理對(duì)UC的效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)因提前采用艾灸干預(yù)，在一定程度上緩解了UC大鼠結(jié)腸組織炎癥。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，隔藥灸預(yù)處理、溫和灸預(yù)處理均能升高大鼠腸黏膜屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)，可以降低腸黏膜組織中炎癥因子的表達(dá)，兩種艾灸預(yù)處理的方法在保護(hù)腸黏膜屏障和降低炎癥反應(yīng)中并無(wú)明顯差異，表明艾灸預(yù)處理可能通過(guò)預(yù)防腸黏膜屏障中相關(guān)蛋白的破壞，保護(hù)和維持腸黏膜屏障的完整性和通透性來(lái)抑制UC的炎癥反應(yīng)，且兩種療法均有效，臨床應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行療法選擇。但是，本研究尚存在不足之處，本研究主要對(duì)腸黏膜屏障中的機(jī)械屏障和化學(xué)屏障中的相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究，而關(guān)于艾灸預(yù)處理是否對(duì)免疫屏障和生物屏障同樣具有保護(hù)作用尚未研究，因此今后可從更多角度深入探討，完善艾灸預(yù)處理防治UC的機(jī)制研究。