藏醫(yī)“白脈病療法”對腦缺血再灌注大鼠CD34、VEGF1、GAP-43蛋白表達的影響＊

2019-01-29 03:40李龍梅鄭麗娟祝日榮仁青加鄧志云李佳林武佳杰任小巧

世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化 2018年9期

李龍梅，鄭麗娟，祝日榮，毛萌，仁青加，鄧志云，李佳林，武佳杰，任小巧＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學研究所北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院北京 100029；3.西藏藏醫(yī)學院藏醫(yī)藥研究所拉薩 850000）

近年來，腦損傷后機體的內源性修復機制的研究逐漸深入，越來越多的研究結果表明，神經(jīng)再生是腦損傷后運動功能恢復的基礎。因此，尋找挖掘能有效增加神經(jīng)再生的醫(yī)療康復手段，同時配合常規(guī)的運動和物理治療，將更加有助于腦卒中患者肢體運動功能的恢復。本研究團隊的實驗發(fā)現(xiàn)白脈病療法對腦缺血大鼠腦組織有保護作用[1]，為進一步探討其作用機制，本實驗應用免疫組化技術分別檢測了CD34蛋白、VEGF1蛋白、GAP-43蛋白在各組大鼠缺血再灌注后7天、14天兩個時間點的表達量，以此評價白脈病療法對于腦缺血大鼠的神經(jīng)和血管再生的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性SD大鼠75只，清潔級（SPF），體重250±10 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。許可證號SCXK（京）2011-0004。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學清潔級動物房，飼養(yǎng)溫度20℃-24℃，正常飲食，自由飲水，適應性飼養(yǎng)5天。所有實驗動物的操作流程及飼養(yǎng)條件均符合實驗動物管理飼養(yǎng)條例，并遵循人道主義原則。

1.1.2 藥物、試劑和設備

如意珍寶丸（生產(chǎn)批號:20150116），購自金科藏藥股份有限公司；白脈軟膏（生產(chǎn)批號:130826），購自西藏奇正藏藥股份有限公司；辛伐他?。耗硸|制藥有限公司；（ZLI-9064）檸檬酸鹽緩沖液、（PV-9001）超敏型抗兔kit、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠抗VEGF單克隆抗體、兔抗GAP-43多克隆抗體，美國Abcam公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000 AB型），天津市泰斯特儀器有限公司；BX40型光學顯微鏡、E320型顯微照相機，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注模型制備

參照Belayev報道的線栓法加以改良后建立右側大腦中動脈栓塞缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。手術前1天禁食，自由飲水。缺血1.5 h后將漏在皮膚外的線栓拔出1 cm并剪斷，使大腦動脈Willis環(huán)和MCA恢復血供，造成缺血再灌注模型，保持體溫至清醒。造模后將動物置于放有清潔墊料的鼠籠內，自由飲水、進食。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。手術過程中室溫保持在24-25℃。

1.2.2 分組與給藥

（1）分組：假手術組10只（Sham，S），其余55只動物于麻醉清醒后6 h時參照Zea Longa[8]5分制評分標準進行神經(jīng)行為學評分，并以此評價、判斷模型是否成功。評分為1-3分的納入本研究。采用隨機表將每個分值的大鼠分配到4組，即模型組（model，M）；陽性對照組（positive control group，P）；如意珍寶丸組(Ruyizhenbao pills group，R)；白脈病療法組(Baimai therapy group，BT)，以此保證每組大鼠神經(jīng)行為學評分沒有顯著性差異。每組又分為缺血再灌注7d、14d兩個亞組。

（2）給藥：各組大鼠每天1次灌胃，并涂抹相應的藥物，從造模后開始給藥至處死。如意珍寶丸組、白脈療法組灌胃給與如意珍寶丸混懸液，灌胃給藥量依據(jù)不同種類動物之間藥物劑量換算法為依據(jù)，按成人（70 kg計算）每日每公斤體質量藥量的6.3倍計算，如意珍寶丸成人每天用量5片，每天2次，每片重0.5 g，折合計算得每100 g體重給藥約0.052 g，用生理鹽水配成0.052 g·ml-1的藥液，即每100 g體重灌胃1 mL藥液，按1 mL·100 g-1體重給予如意珍寶丸灌胃；陽性對照藥組灌胃給予辛伐他丁混懸液，成人每天用量辛伐他丁片以1 mL生理鹽水配0.01 mg的藥物配制，按1 mL·100 g-1體重給予辛伐他丁片灌胃。假手術組、模型組按1 mL·100 g-1體重給予生理鹽水灌胃（normal saline，NS），每天1次至處死；每組2個亞組給藥分別持續(xù)7天、14天。白脈病療法組在大鼠患肢涂白脈軟膏，每天2次，每次1 g并按摩5 min；假手術組、模型組和陽性對照組均于大鼠患肢涂凡士林。

1.2.3 指標檢測：

（1）常規(guī)檢測：每天對各組大鼠皮毛狀態(tài)觀察并記錄；

（2）行為學檢測：分別與大鼠造模后3天、7天、14天，對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分，主要應用“姿勢反射測驗（postural reflex test）”[2]。

（3）腦缺血大鼠腦組織病理學[1]

（4）免疫組化檢測CD34、VEGF1、GAP-43的表達情況。

取材:于造模成功后7天、14天取材，經(jīng)腹腔水合氯醛麻醉后斷頭取腦，每組取5只大鼠心臟灌注，沿胸骨左側剪開胸腔，從左心室進針，插入到主動脈，固定針頭，剪開右心耳，快速滴入預冷生理鹽水（10 mL·min-1），無血污后改滴入4%多聚甲醛（5-10 mL·min-1），先快后慢，約250 mL，開顱取腦，4%多聚甲醛固定2天，石蠟包埋。

免疫組化SP法:石蠟包埋后進行免疫組化，采用免疫組化SP法，具體流程如下：脫蠟、水化組織切片；0.01 mol·L-1PBS洗三次各2 min；組織切片置于枸櫞酸鹽微波修復抗原修復；用3%H2O2，室溫封閉10 min；PBS洗兩次各3 min；滴加一抗（CD34為1：100，GAP-43、VEGF1均為1∶200），4℃過夜（4℃過夜后次日組織需在37℃復溫45 min）。復溫，PBS沖洗2 min×3次；滴加超敏二步法免疫組化檢測試劑盒中的試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育10 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加試劑2（辣根酶標記抗兔IgG聚合物），37℃孵育10 min；PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色：滴加DAB顯色劑顯色10 min(鏡下掌握顯色程度，若10 min顯色不足可適當延長時間)；蒸餾水洗終止顯色反應；酒精梯度脫水、二甲苯透明、封片、鏡檢。

從標本中隨機取部分切片，用0.01 mol·L-1PBS代替一抗，其余步驟相同，作為陰性對照。

觀測指標

CD34指標的觀察位置：大鼠缺血側皮層CD34陽性細胞數(shù)。

VEGF1指標觀測位置：每只動物隨機取免疫組化切片5張，在高倍鏡下（×200）計數(shù)大鼠皮層VEGF1陽性細胞，取其均值作為VEGF1陽性細胞數(shù)。

GAP-43指標觀測位置：每只動物隨機取免疫組化切片5張，在高倍鏡下（×200）計數(shù)海馬齒狀回顆粒細胞區(qū)內1/3、顆粒下區(qū)GAP-43陽性細胞，取其均值作為海馬海馬齒狀回的顆粒下層（SGZ）的GAP-43陽性細胞數(shù)。拍照定位參考《大鼠腦立體定位圖譜》。

表1 各組大鼠姿勢反射測驗（postural reflex test）比較(xˉ±s)

表2 不同時間點大鼠大腦皮層CD34在大腦皮質的表達(xˉ±s)

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)資料使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)依標準差(xˉ±s)表示，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素方差分析，兩組間的比較采用LSD檢驗；若不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗，以P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 常規(guī)檢測

每天對各組大鼠進行皮毛觀測并記錄，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后前3天，各組大鼠毛發(fā)顏色差異不明顯，隨著缺血再灌注時間的增加，各組大鼠毛發(fā)狀態(tài)呈現(xiàn)差異，7天后開始明顯。具體為：白脈病療法組的大鼠毛色光澤度較好，色白，接近自然狀態(tài)，和假手術組沒有顯著性差異，與模型組及其他兩組治療組相比，好于這三組（M組、P組、R組）；如意珍寶丸組和陽性組沒有顯著性差異；模型組毛發(fā)情況最差，毛色枯黃成束狀。

2.2 行為學檢測

分別與大鼠造模后3天、7天、14天，對各組大鼠進行“姿勢反射測驗（postural reflex test）”。姿勢反射測驗結果表明：術后第3天，缺血再灌注各組與假手術組相比，行為學評分均低于假手術組，P＜0.05；如意珍寶丸組和白脈病療法組大鼠的行為學評分高于模型組，P＜0.05；術后第7天，缺血再灌注各組與假手術組相比，行為學評分均低于假手術組，P＜0.05；白脈病療法組、如意珍寶丸組大鼠行為學評分高于模型組，有顯著性差異，；術后第14天，缺血再灌注各組與假手術組相比，行為學評分均低于假手術組，P＜0.05；白脈病療法組、如意珍寶丸組大鼠行為學評分高于模型組，P＜0.05（表1）。

2.3 組織病理學結果

假手術組7天皮層神經(jīng)元結構完整，數(shù)量多，核圓、大，偶見核固縮，14天與7天比較無明顯差異。模型組7天神經(jīng)元排列紊亂，部分細胞排列疏松，細胞核固縮，深染，周圍出現(xiàn)空泡，正常神經(jīng)元數(shù)量減少；14天見大量細胞溶解后殘留的痕跡，細胞稀疏，排列紊亂。陽性組7天神經(jīng)元排列疏松，偶見細胞核皺縮，深染；14天正常神經(jīng)元數(shù)量進一步減少，核固縮細胞增加，細胞間的空泡區(qū)域增多。7天如意珍寶丸組有少量核固縮細胞，與模型組相比明顯少，與假手術組相比沒有顯著差別；7天白脈病療法組有少量核固縮細胞，與模型組相比明顯較少，與假手術組相比沒有顯著差別；14天白脈病療法組核固縮細胞比7天多，但與模型組相比明顯少許多，有顯著性差異（圖1）。

2.4 CD34、VEGF1、GAP-43免疫組化檢測結果

2.4.1 CD34判定標準

任何被CD34抗體染成棕黃色細胞或細胞簇均可視為陽性表達，參照weidner法即與背景明顯分別的任何一個棕色的內皮細胞或細胞叢作為一個血管，只要結構不連續(xù)，分支結構也可作為一個血管。每張染色切片先在低倍鏡下（×40）于腦缺血皮層尋找3個微血管密集區(qū)，隨后再在高倍鏡下（×200）下計算5個不同視野中的微血管數(shù)，取其均值作為本張片子CD34的值。免疫組化結果顯示，梗死區(qū)域幾乎沒有血管新生，新生的血管主要集中在缺血半暗帶中，血管形態(tài)扭曲并且不規(guī)則。術后7天、14天假手術組微血管有少量表達，術后7天、14天，白脈病療法組、如意珍寶丸組與模型組、陽性對照組比較微血管顯著增加，且有統(tǒng)計意義（P ＜ 0.05）（表2）。

2.4.2 VEGF1

腦缺血再灌注損傷后7天，如意珍寶丸組、白脈軟膏組、白療組三組大鼠腦缺血側皮層的VEGF1陽性細胞積分光密度高于假手術組、模型組和陽性組，且有顯著性差異（P＜0.05）；白脈病療法組、如意珍寶丸組VEGF1陽性細胞表達高于假手術組及模型組，且均有顯著性差異（P＜0.05）。14天各組VEGF1陽性細胞數(shù)較7天均有所下降，陽性組、如意珍寶丸組、白脈病療法組均高于假手術組和模型組與模型組。7天、14天，如意珍寶丸組VEGF1陽性細胞表達高于陽性對照組、白脈病療法組，且均有顯著性差異（P＜0.05）（表3）。

2.4.3 GAP-43

腦缺血損傷后7天，如意珍寶丸組、白脈病療法組GAP-43陽性細胞積分光密度與模型組、陽性對照組比較，均顯著增高，且有顯著性差異（P＜0.05），而如意珍寶丸組于白脈病療法組比較無顯著形成以；14天時如意珍寶丸組、白脈病療法組高于模型組、陽性對照組，且有顯著性差異（P＜0.05），而白脈病療法組GAP-43高于如意珍寶丸組，有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

3 討論

藏醫(yī)白脈病療法是臨床上治療腦卒中經(jīng)典治療方法，有研究證明本研究所選藥物在改善卒中患者肢體運動功能方面具有較好療效[3]。本實驗從神經(jīng)血管再生角度觀察了藏醫(yī)白脈病療法對于缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用，從HE染色及神經(jīng)功能評分可以看出白脈病療法對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用。本研究又從CD34、VEGF1、GAP-43的表達情況對其作用機理的進行了進一步的探討。

以往認為成年后大腦血管內皮細胞已經(jīng)停止增生，但動物實驗證明局灶性缺血后有新的血管生成。毛細血管生成在腦卒中后2-7天會于缺血灶邊緣區(qū)開始出現(xiàn)，這些血管早期表現(xiàn)是梗死灶邊緣區(qū)的大管徑薄壁血管，然后（腦卒中后2-28天）這些薄壁血管通過發(fā)芽和分枝形成小血管，并逐漸進入梗死灶[4]，從而有利于神經(jīng)功能的再塑。諸多研究表明，腦組織血管密度高的缺血性腦血管病患者預后明顯好于血管密度低的患者，缺血區(qū)腦組織的血管新生可明顯改善缺血區(qū)周圍的組織灌流，彌補血流量下降導致的腦損傷，促使神經(jīng)功能盡可能恢復。CD34在維持此動態(tài)平衡中起著重要的作用，在缺血缺氧等因素可降低CD34數(shù)量并破壞其功能，使內皮細胞功能受損，最終造成組織缺血[5]。CD34減少的程度已被用來評價內皮細胞功能受損的程度。本研究顯示，術后7天白脈病療法組、如意珍寶丸組較模型組比較，CD34表達顯著增加；術后14天，白脈病療法組、如意珍寶丸組與模型組、陽性對照組比較，CD34表達量均明顯增加，同時14 d時白脈病療法組與如意珍寶丸組比較，明顯較高，有顯著差異，說明白脈病療法組在促進CD34蛋白表達方面較單純應用如意珍寶丸治療有明顯的時間相關性，同時也說明綜合治療手段比單純應用某種藥物治療更具有優(yōu)勢。

表3 不同時間點大鼠皮層VEGF1陽性細胞積分光密度(xˉ±s)

表4 不同時間點大鼠SGZ區(qū)GAP-43陽性細胞積分光密度(xˉ±s)

血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，具有促進血管形成的作用[6，7]本實驗選擇Anti-VEGF antibody[VG-1]（ab1316）來檢測各治療組對于血管再生的調節(jié)作用，其可以誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡，誘導血管透化作用。本研究結果表明，腦缺血再灌注7天、14天時，如意珍寶丸、白脈病療法治療組均可以提高大鼠腦缺血后梗死區(qū)的VEGF1的表達，如意珍寶丸組作用最明顯，此結果與14天時CD34的陽性表達反應白脈病療法組優(yōu)于如意珍寶丸組的結果有些不一致，可能因為，一是如意珍寶丸的作用主要在調節(jié)血管內皮的功能而發(fā)揮作用，而白脈病療法屬于綜合治療，其作用的發(fā)揮可能有更多的途徑；二是實驗例數(shù)較少，在統(tǒng)計學上未能反應出白脈病療法綜合治療在改善VEGF1表達上的優(yōu)勢，需要進一步研究。

生長相關蛋白（GAP-43）在神經(jīng)組織中廣泛存在，是一種胞膜磷酸蛋白質，它是一種神經(jīng)特異性的蛋白質，在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高，研究表明其主要參與神經(jīng)細胞外生長，突觸發(fā)育的形成和神經(jīng)細胞的再生[8]，所以可以被用作軸突生長的標記物。GAP-43在正常腦組織亦有一定量的表達，陽性細胞主要分布于大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層、齒狀回顆粒細胞下層（subgranular zone，SGZ）、門區(qū)等[9]。本實驗主要分析海馬齒狀回GAP-43陽性細胞，陽性神經(jīng)細胞多呈顆粒狀。研究表明，7天、14天時如意珍寶丸組、白脈病療法組GAP-43陽性表達均明顯高于模型組、陽性對照組，而7天時如意珍寶丸組與白脈病療法組比較無顯著性；至14天時白脈病療法組GAP-43高于如意珍寶丸組，說明白脈病療法綜合治療方法在促進神經(jīng)的再生方面明顯優(yōu)于單純的藥物治療方法。

總之，白脈病療法可促進腦缺血再灌注大鼠GAP-43、VEGF1、CD34的陽性表達，促進微血管增生，說明腦缺血可誘導側支循壞的建立和微血管網(wǎng)的再建，起到神經(jīng)保護的作用。其機理有待進一步探討。

附錄