高新譜，張瑋曄，史源，范鵬飛，王清平，沈中陽（1.天津醫(yī)科大學(xué),天津 300070；.天津市第一中心醫(yī)院，天津 30019；3.中國人體器官捐獻(xiàn)管理中心，北京 100010）

近年來，公民逝世后器官捐獻(xiàn)（donated after circulatory death，DCD）成為解決國內(nèi)器官短缺的主要途徑，由于部分類型的邊緣供腎熱缺血時間較長，導(dǎo)致熱缺血損傷較重［1-3］，腎移植術(shù)后植入功能不良（poor graft function，PGF）、延遲性移植物恢復(fù)功能（delayed graft function，DGF）等并發(fā)癥發(fā)生率不斷增加，也對傳統(tǒng)經(jīng)典UW液靜息低溫保存技術(shù)（static cold storage，SCS）提出了新的挑戰(zhàn)，SCS保存技術(shù)已無法滿足日益增長的臨床需求，因此，需要研發(fā)新型器官保存技術(shù)以滿足臨床實際需求［4-6］。本研究通過穩(wěn)定的豬自體腎移植模型，研究常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）保存技術(shù)對豬DCD供腎活力評估、提高供腎保存質(zhì)量的意義及其相關(guān)機制。

1 資料和方法

1.1 選用由薊縣實驗動物基地提供得成年雄性小型豬10只，體重30～35 kg，術(shù)前禁食24 h，禁水8 h。所有動物處置遵照天津市《實驗動物管理條例》。按照保存方式不同隨機分為2組，實驗組（NMP保存組，n=5）：熱缺血30 min后獲取供腎，NMP保存7 h后，行自體腎移植術(shù)；對照組（SCS保存組，n=5）：熱缺血30 min后獲取供腎，4℃低溫環(huán)境下，UW靜息保存7 h后行自體腎移植術(shù)。

1.2 供體手術(shù)：麻醉誘導(dǎo)采用3%戊巴比妥鈉1 ml/kg，氣管插管，呼吸機維持呼吸。正中切口逐層入腹，游離雙腎動脈、腎靜脈，輸尿管置管引流。肝素化（500 U/kg）10 min后獲取供體血液200 ml，存儲于血袋備NMP保存使用。熱缺血30 min后獲取雙側(cè)腎臟，使用4℃UW液（2000 U/L肝素）1000 ml灌注，然后根據(jù)不同保存方法進(jìn)行保存。

1.3 保存方法及裝置：對照組采用500 ml UW液4℃低溫保存。實驗組NMP循環(huán)保存液包括200 ml全血，300 ml生理鹽水，300 ml低分子右旋糖苷-40，水溶性維生素10 ml，5%碳酸氫鈉20 ml，地塞米松10 ml，還原性谷胱甘肽600 mg，復(fù)合氨基酸30 ml，注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉1.5 g，12 500 U肝素，10 ml葡萄糖酸鈣。根據(jù)血氣分析結(jié)果添加碳酸氫鈉。維持灌注壓力40～70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），氧流量0.5 L/min，37℃環(huán)境。

1.4 自體腎移植：在腎臟保存結(jié)束后重新麻醉及氣管插管，Satinsky鉗阻斷下腔靜脈及腹主動脈，采用端-側(cè)縫合分別將腎靜脈連續(xù)縫合在下腔靜脈，將腎動脈與腹主動脈連續(xù)縫合，靜脈推注500 mg甲強龍后，并使用膠體液快速輸注，維持血壓在100 mmHg以上，其后開放血流，供、受體輸尿管使用6～0 Proline線側(cè)-側(cè)連續(xù)縫合重建，逐層關(guān)腹，拔除頸動脈插管，留置中心靜脈導(dǎo)管，便于術(shù)后輸液采血。待肌力恢復(fù)、自主呼吸后拔除氣管插管，放回飼養(yǎng)籠并持續(xù)補液。術(shù)后3 d，每天給予頭孢塞夫（3 mg/kg）、甲硝唑500 mg預(yù)防感染。術(shù)后每天觀察尿量并補液。

1.5 術(shù)后標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)：在各時間點比較兩組動物術(shù)后移植腎血清肌酐水平、炎癥因子表達(dá)、凋亡、腎皮質(zhì)微循環(huán)、術(shù)后7 d生存率等指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：實驗結(jié)果采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表示，使用t檢驗或方差分析比較各組樣本均數(shù)，計數(shù)資料采用卡方檢驗。生存分析采用K-M生存曲線。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)基本情況（表1）：動物體重、供腎重量、供腎熱缺血時間、供腎保存時間、手術(shù)時間、血管重建時間等指標(biāo)，兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

兩組供腎經(jīng)歷30 min熱缺血顏色深暗，表面呈灌注不均花斑狀表現(xiàn)（圖1A），NMP灌注保存1 h后腎臟顏色紅潤且均勻一致（圖1B），對照組供腎始終為花斑狀。移植腎血流開放后，實驗組移植腎臟，迅速恢復(fù)顏色紅潤且均勻一致，很快有尿液產(chǎn)生（圖1C），對照組移植腎臟恢復(fù)較慢，顏色偏暗呈灌注不均狀（圖1D），少尿或無尿。

表1 兩組小型豬自體腎移植的基本情況

圖1 供腎熱缺血30分鐘（A）；NMP保存中（B）；實驗組血流開放后（C）；對照組血流開放后（D）

2.2 灌注期間相關(guān)指標(biāo)變化：實驗組灌注期間雙腎灌注壓力穩(wěn)定（圖2），灌注流量穩(wěn)定（圖3），雙腎尿量逐漸增加（圖4）。

圖2 灌注保存期間左腎（A）及右腎（B）動脈灌注壓力變化

圖3 灌注保存期間左腎（A）及右腎（B）動脈灌注流量變化

圖4 灌注保存期間左腎（A）及右腎（B）尿量變化

2.3 自體腎移植術(shù)后血清肌酐檢測（表2）：自體腎移植術(shù)后1 d，對照組血清肌酐水平較實驗組明顯升高，術(shù)后3、7 d，實驗組血清肌酐水平逐漸降低，接近正常，對照組恢復(fù)緩慢，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 自體腎移植術(shù)后血清肌酐水平變化

2.4 腎組織常規(guī)病理檢查：熱缺血30 min后，腎小管局灶性凝固性壞死，腎小管呈中度水樣變性、空泡變性。實驗組保存1 h后空泡變性、水樣變性明顯減輕，保存2、3、4、5、6、7 h各時間點供腎損傷無明顯加重，空泡變性較輕，腎小管無明顯損傷。對照組1 h后空泡變性、水樣變性明顯，損傷較重。3、4、5、6、7 h各時間點供腎損傷逐漸加重，出現(xiàn)彌漫性滴狀變性及空泡變性，并出現(xiàn)腎小管擴張損害。

術(shù)后24 h實驗組及對照組移植腎病理（圖5）。實驗組移植腎皮質(zhì)炎癥反應(yīng)較輕，髓質(zhì)透明管型較少，腎小球形態(tài)相對正常，對照組炎癥反應(yīng)重，髓質(zhì)管型較多，腎小球形態(tài)異常。

圖5 自體腎移植后24 h，移植腎穿刺活檢病理（HE染色，放大20倍），炎癥反應(yīng)（如*所示）及透明管型（如箭頭所示）

2.5 腎組織免疫組化

2.5.1 腎動脈開放后24 h腎組織ET-1表達(dá)（圖6）：腎組織ET-1免疫組化，實驗組開放后24 h ET-1陽性表達(dá)明顯低于對照組，半定量評分分別為（2.42±0.57）比（6.65±1.87）（P＜0.05），兩組間相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5.2 腎動脈開放后24 h腎組織caspase-3表達(dá)（圖7）：自體腎移植術(shù)后24 h移植腎caspase-3陽性表達(dá)明顯低于對照組，半定量評分分別為（9.06±2.31）比（16.90±4.25）（P ＜ 0.05），兩組間相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖7 術(shù)后24 h腎組織caspase-3表達(dá)半定量評分

2.6 腎組織TUNEL法凋亡檢測：開放后腎組織TUNEL法凋亡定量法檢測，實驗組開放后24 h凋亡細(xì)胞陽性率，較對照組明顯降低，分別為（9.62±2.59）% 比（32.20±5.93）%（P＜ 0.05），兩組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 腎皮質(zhì)微循環(huán)血流監(jiān)測（圖8）：移植后24 h實驗組單位面積內(nèi)腎皮質(zhì)血流明顯高于對照組，分別為（2 983.83±360.83）比（780.53±143.38） BPU（P＜0.05），兩組間相比亦有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.8 術(shù)后1周生存率比較：5只對照組動物術(shù)后1周存活率分別為100%（5/5）。5只實驗組動物存活亦超過7 d，術(shù)后1周存活率為100%（5/5），與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 腎動脈開放后24 h腎皮質(zhì)微循環(huán)監(jiān)測

3 討 論

3.1 NMP對DCD供腎的保護(hù)作用：在缺血缺氧的低溫環(huán)境下，代謝底物缺乏。氧供缺乏導(dǎo)致細(xì)胞ATP供應(yīng)由無氧酵解產(chǎn)生，生成丙酮酸、乳酸導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)及線粒體基質(zhì)pH值降低，ATP耗竭導(dǎo)致鈉-鉀ATP泵功能異常，破壞細(xì)胞膜及線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換及細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)激活凋亡途徑［7］，并導(dǎo)致開放后中性粒細(xì)胞及血小板聚集于竇狀隙，最后導(dǎo)致開放后肝竇微循環(huán)血流明顯降低，甚至局部完全無血流［8］。NMP是在生理環(huán)境下保存供體器官，徹底改變了傳統(tǒng)低溫保存的理論［9］，NMP對DCD供腎具有一定修復(fù)作用［10-11］。

本研究結(jié)果證實相對與UW液SCS低溫保存，NMP對DCD供腎的保存具一定優(yōu)勢，證據(jù)如下：自體腎移植術(shù)后1 d，對照組血清肌酐水平較實驗組明顯升高，實驗組術(shù)后3、7 d，實驗組血清肌酐水平逐漸下降，接近正常，對照組恢復(fù)緩慢。熱缺血30 min后，腎小管局灶性凝固性壞死，腎小管呈中度水樣變性、空泡變性。NMP組保存后空泡變性、水樣變性明顯減輕，UW液組各時間點供腎損傷逐漸加重，出現(xiàn)彌漫性滴狀變性及空泡變性，并出現(xiàn)腎小管擴張損害。雖然兩組生存率無統(tǒng)計學(xué)差異，但是樣本量偏少，需要進(jìn)一步實驗證實對移植物生存率及受體生存率影響。

3.2 NMP對DCD供腎的保護(hù)作用具體機制：本研究證實，NMP保存通過降低腎組織ET-1表達(dá)改善供腎微循環(huán)，減輕微循環(huán)紊亂，實驗組開放后24 h ET-1陽性表達(dá)明顯低于對照組。移植術(shù)后24 h實驗組單位面積內(nèi)腎皮質(zhì)血流明顯高于對照組。腎微循環(huán)障礙與ET-1水平升高有密切關(guān)系，ET-1可以強烈持久的收縮腎小球出、入球動脈，造成時腎皮質(zhì)微血管強烈收縮，微循環(huán)障礙，從而影響腎實質(zhì)的血液灌注，加上低溫、缺血、缺氧共同加重腎臟損傷［12-15］。

本研究中，NMP保存DCD供腎始終處于生理環(huán)境，而且始終保持血管切應(yīng)力，不僅避免了冷缺血對微循環(huán)的影響，通過降低腎組織ET-1表達(dá)及改善微循環(huán)，改善供腎血供，進(jìn)而改善術(shù)后移植腎臟功能。

本研究還證實NMP通過降低caspase-3水平減少腎實質(zhì)細(xì)胞凋亡，實驗組開放后24 h caspase-3陽性表達(dá)明顯低于對照組。開放后腎組織TUNEL法凋亡定量法檢測結(jié)果，自體腎移植術(shù)后24 h凋亡細(xì)胞陽性率，實驗組較對照組明顯降低。本實驗中NMP保存組移植后24 h，實驗組不僅腎組織caspase-3陽性表達(dá)明顯低于對照組，而且腎實質(zhì)細(xì)胞凋亡率明顯下降，因此可證實NMP通過降低caspase-3水平減少腎實質(zhì)細(xì)胞凋亡。

3.3 總結(jié)及本研究局限性：本研究成功建立雙腎NMP保存裝置，可明顯減輕DCD供腎保存損傷及缺血/再灌注損傷，其保護(hù)機制涉及降低腎組織ET-1表達(dá)及改善供腎微循環(huán)，降低caspase-3水平及凋亡減輕缺血/再灌注損傷。本研究局限性：① 樣本量較少；② 自體模型缺少免疫因素；③ 觀察時間較短；④ 損傷機制不全面，例如細(xì)胞因子釋放、炎癥細(xì)胞浸潤、ATP耗竭等；⑤ 7 h保存時間尚需延長；⑥ 需要和HMP保存技術(shù)對比；⑦ 裝置需要進(jìn)一步優(yōu)化與工業(yè)設(shè)計。在未來研究中將克服這些局限及缺陷。