賈 欣，郝永偉，張超鋒，侯 琳，高珊珊，杜 娟

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)是我國獨立研制的第二代半合成光敏劑，已在臨床上試用于治療鮮紅斑痣和視網(wǎng)膜黃斑變性等疾病[1-3]。研究[4]表明，其用于腫瘤的光動力治療效果顯著，但因其水溶性差，臨床應用受到限制。有研究[5]報道，將藥物包載于納米載體中，可利用實體瘤的高滲透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR效應)將藥物被動靶向到腫瘤組織中，并延長藥物血液循環(huán)時間。聚乳酸羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)生物相容性好，被美國FDA批準作為藥用輔料，也被用于藥物或者光敏劑遞送，以期實現(xiàn)靶向、緩釋等目的[6-7]。本研究將HMME負載于PLGA納米粒中，并在其表面覆蓋二氧化錳(MnO2)層，制備PLGA/HMME@MnO2系統(tǒng)，然后采用高效液相色譜法考察該制劑在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)；并以荷S180腹水瘤小鼠為模型，研究其對腫瘤的抑制效果。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器PLGA(濟南岱罡生物科技有限公司)，HMME(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，聚乙烯醇(PVA，聚合度1 788±50，成都市科龍化工試劑廠)，2-(N-嗎啡啉) 乙磺酸(MES，國藥集團化學試劑有限公司)，高錳酸鉀(洛陽市化學試劑廠)，PLGA/HMME和PLGA/HMME@MnO2為自制。S180腹水瘤細胞(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)，雌性SPF級昆明小鼠和SD大鼠(河南省實驗動物中心)。Agilent1200 series HPLC色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司)。

1.2血漿中藥物濃度的測定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱： Inertex C18 柱， 250 mm×4.6 mm， 5 μm；流動相：0.2 g/L 醋酸鈉(用冰醋酸調(diào)pH至5.0)∶四氫呋喃=60∶40(體積比)；流速：1.0 mL/min；檢測器：熒光檢測器；激發(fā)波長：395 nm；發(fā)射波長：613 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

1.2.2 血漿樣品處理 取100 μL大鼠血漿樣品， 加入3 mL乙腈-甲醇(V乙腈∶V甲醇=3∶1)混合液，渦旋振蕩3 min， 12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至5 mL EP管中，室溫條件下通氮氣揮干；將EP管底部的殘渣用100 μL乙腈復溶，超聲30 min，12 000 r/min離心15 min；取上清液，采用 “1.2.1”的條件，應用HPLC法測定血漿中的藥物濃度。

1.2.3 HMME含量測定方法的專屬性考察及標準曲線的建立 將空白血漿、生物樣品和模擬生物樣品分別按照“1.2.1”和“1.2.2”方法進行分析檢測，考察HMME含量測定方法的專屬性。其中，生物樣品為注射HMME的SD大鼠血漿，而模擬生物樣品為加入適量HMME的空白SD大鼠血漿。稱取適量的HMME原料藥，用適量乙腈溶解后轉移至容量瓶中進行定容，配制成1 000 mg/L的HMME 貯備液。再把該貯備液依次稀釋配制成100.0、75.0、50.0、25.0、12.5、5.0、1.0和0.5 mg/L的系列溶液。取血漿樣品100 μL，分別加入上述系列溶液，按照 “1.2.1”、“1.2.2” 方法進行檢測。以HMME質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立血漿模擬生物樣品的標準曲線。

1.3大鼠體內(nèi)藥物動力學研究方法將體重約200 g的SD大鼠隨機分為HMME組、PLGA/HMME組和PLGA/HMME@MnO2組(每組3只)，給藥前的12 h內(nèi)禁食，充足飲水。采取經(jīng)尾靜脈注射給藥的方式，各組中HMME的給藥劑量為5.0 mg/kg。分別在給藥10、30 min，1、2、4、6和8 h后從眼底靜脈叢取血，血樣置于1.5 mL經(jīng)肝素鈉溶液潤洗的離心管中，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照1.2.2的方法應用HPLC檢測HMME質(zhì)量濃度，建立血藥濃度-時間曲線。鑒于非房室模型解決了不能用相同房室模型擬合全部實驗數(shù)據(jù)的問題，利用PK solver V 2.0軟件的 “藥動學非房室模型分析-靜注給藥”模塊計算各制劑的藥物動力學參數(shù)。

1.4體內(nèi)抗腫瘤作用研究

1.4.1 腫瘤模型的建立 復蘇凍存的S180腹水瘤細胞，腹腔注射到SPF級昆明小鼠體內(nèi)，飼養(yǎng)約一周后，小鼠腹部可觸及明顯的積水樣腫大，即為S180腹水瘤小鼠。從S180腹水瘤小鼠腹部抽取腹水，用生理鹽水稀釋，每只小鼠腋窩接種S180細胞約1×107個。

1.4.2 實驗方案及治療效果檢測 SPF級昆明小鼠腫瘤接種成功后，挑選腫瘤體積為100～150 mm3的小鼠分組(每組6只)，開展藥效學實驗。動物分組如下：生理鹽水(A組)、生理鹽水+激光組(B組)、HMME+激光組(C組)、 PLGA/HMME+激光組(D組)、 PLGA@MnO2(E組)、 PLGA/HMME@MnO2+激光組 (F組)，其中HMME給藥劑量為3.0 mg/kg。給藥方式為尾靜脈注射給藥，在第1、3、5、7和9天各給藥一次。給藥前測定實驗動物體重并記錄，使用電子游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按照0.5×a×b2計算腫瘤體積。相對腫瘤體積為V/V0(V為實驗點測量的腫瘤體積，V0為開始給藥時的腫瘤初始體積)。給藥4 h后在腫瘤部位施加532 nm激光進行均勻照射(1.5 W/cm2，1.5 min)。通過相對腫瘤體積變化及體重變化分析治療效果及制劑生物相容性。

1.4.3 腫瘤組織病理變化 藥效學實驗結束后，按照國際規(guī)程處死小鼠，解剖取出腫瘤組織，使用體積分數(shù)10%中性福爾馬林固定，進行石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色等操作。在顯微鏡下觀察腫瘤樣本的病理學變化并拍照。

1.5統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 5.0進行分析，應用單因素方差分析比較非房室模型藥物動力學參數(shù)的差異，應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組小鼠相對腫瘤體積和小鼠體重的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1HMME含量測定方法專屬性考察見圖1。采用HPLC法測定血漿中HMME的質(zhì)量濃度，HMME的保留時間約6.1 min。如圖1所示，所建立的分析方法專屬性符合要求，血漿內(nèi)源性物質(zhì)出峰時間較短，不影響HMME含量的測定。

A：空白血漿樣品；B ：生物樣品；C ：模擬生物樣品

HMME質(zhì)量濃度(x)和其相應的峰面積(y)之間呈線性相關，所建立的標準曲線線性關系良好，y=7.812×106x+746 417，R2=0.999，定量范圍為0.065～25.0 mg/L。在標準曲線范圍內(nèi)，方法的批內(nèi)、批間精密度RSD均小于3%，方法回收率為96.42%～102.44%，提取回收率為85.17%～94.80%，符合生物樣品分析要求。

2.2藥時曲線及藥動學參數(shù)見表1。由表1可知，與HMME相比，PLGA/HMME和PLGA/HMME@MnO2均延長了藥物在血液中的循環(huán)時間，半衰期(t1/2)分別為HMME的2.71和9.32倍；AUC顯著增加。說明PLGA/HMME@MnO2具有明顯的長循環(huán)特性，有利于HMME在腫瘤部位蓄積。

表1 非房室模型藥物動力學參數(shù)(n=3)

AUC：藥時曲線下面積；AUMC：統(tǒng)計矩藥時曲線下面積；MRT：平均滯留時間；Cl：清除率；Vss：表觀分布容積

2.3體內(nèi)藥效學實驗

2.3.1 實驗動物體重和腫瘤體積變化 見表2、3。由表2可知，隨著時間的延長，A組、B組和E組小鼠的腫瘤體積均不斷增加。相比之下，治療結束時，C組、D組 和F組小鼠的相對腫瘤體積明顯下降。其中，F(xiàn)組相對腫瘤體積最小。由表3可知，各組小鼠體重隨著飼養(yǎng)時間延長，體重穩(wěn)步增長。相比之下，各組動物體重有一定差異，說明各個治療組小鼠的體重受治療的影響，進而證明了不同治療方式的作用有所不同。

表2 各組小鼠相對腫瘤體積變化(n=6)

F組間=89.690，P<0.001；F時間=86.740，P<0.001；F交互=13.670，P<0.001

表3 各組小鼠體重變化(n=6)

F組間=5.523，P=0.002；F時間=26.840，P<0.001;F交互=0.205，P>0.999

2.3.2 腫瘤組織HE染色 見圖2。與生理鹽水組相比，生理鹽水+激光組和PLGA@MnO2組腫瘤組織無明顯變化，呈現(xiàn)細胞生長旺盛、排列緊密等惡性腫瘤特點。HMME+激光組、PLGA/HMME+激光組和PLGA/HMME@MnO2+激光組腫瘤組織呈現(xiàn)明顯的腫瘤細胞壞死、細胞核裂解和細胞間隙增大等特征。

A～F:分別為A、B、C、D、E、F組；標尺長度：50 μm

3 討論

該研究中，作者用具有緩釋作用的PLGA材料包載HMME，并在表面包覆MnO2納米層，以期延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，進而實現(xiàn)減少給藥次數(shù)、提高療效的目的。首先，作者建立了HMME的體內(nèi)分析方法，結果表明，該方法特異性好、靈敏度高，是體內(nèi)檢測HMME質(zhì)量濃度的合適方法。t1/2、AUC等藥物動力學參數(shù)表明，與HMME相比，PLGA/HMME@MnO2顯著延緩了藥物的消除速度，延長了藥物循環(huán)時間，這些體內(nèi)過程的改善一方面與所使用的緩釋材料PLGA有關，另外一個方面可能與MnO2的包覆以及載體系統(tǒng)在體內(nèi)滯留時間長有關。相比于傳統(tǒng)的PLGA納米粒，MnO2納米層的引入不但有助于提高藥物穩(wěn)定性，而且也有助于改變納米粒表面粗糙度。

相對腫瘤體積、腫瘤HE染色表明，PLGA/HMME@MnO2具有較好的抗腫瘤效果，這是由于該納米材料可通過EPR效應被動靶向滲透進入腫瘤組織。更多的HMME被遞送進入腫瘤，為532 nm激光照射腫瘤產(chǎn)生活性氧奠定基礎。在532 nm激光照射下，HMME產(chǎn)生活性氧損傷腫瘤細胞，是其抗腫瘤作用的主要機制。還原型谷胱甘肽是細胞內(nèi)的一種內(nèi)源性抗氧化劑，可以和細胞內(nèi)的活性氧等自由基反應以保護細胞生物膜以及重要的細胞器。研究[8]表明，相對于正常組織，腫瘤組織內(nèi)谷胱甘肽濃度偏高，高達2～10 mmol/L。MnO2包覆的納米粒進入腫瘤細胞后，在高水平還原型谷胱甘肽和H2O2刺激下，MnO2不但和還原型谷胱甘肽反應，降低還原性谷胱甘肽濃度，使得活性氧的耗竭減少；還可以催化H2O2生成氧氣，使得氧氣供給增加，施加532 nm激光后，可使激發(fā)態(tài)的HMME能有效地把能量傳遞給氧氣分子，生成更多活性氧，進而對腫瘤細胞生長產(chǎn)生強有力的抑制作用[9-10]。

綜上所述，PLGA/HMME@MnO2作為一種有潛力的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)，能夠實現(xiàn)體內(nèi)長循環(huán)，可高效靶向于腫瘤，為腫瘤的增強光動力治療開拓了新的途徑。