羅天霞，樊紅琨，李立人，閆寧寧，章 茜

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 鄭州 450001

Junctophilin2(JP2)位于心肌細(xì)胞偶聯(lián)膜復(fù)合體，是一種膜結(jié)合蛋白，可與細(xì)胞膜和內(nèi)(肌)質(zhì)網(wǎng)膜相互作用，在心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)過程中起到至關(guān)重要的作用[1]。在肥厚性心肌病和心力衰竭等心臟疾病中JP2蛋白表達(dá)下調(diào)，可引起心肌細(xì)胞興奮-收縮失偶聯(lián)[2]。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道屬于鈣激活鉀通道家族，參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化末期的構(gòu)成。而動(dòng)作電位復(fù)極化末期相當(dāng)于心肌細(xì)胞興奮性的相對(duì)不應(yīng)期和超常期，臨床發(fā)生的心律失常多見于這一時(shí)期。因此SK2通道與心律失常發(fā)生的分子機(jī)制有關(guān)[3-4]。JP2作為參與細(xì)胞膜與肌質(zhì)網(wǎng)膜偶聯(lián)膜復(fù)合體關(guān)鍵蛋白，是否與SK2通道具有相互作用，所知甚少。該實(shí)驗(yàn)主要研究大鼠心肌細(xì)胞系H9c2中JP2蛋白與SK2通道是否存在相互作用，為后續(xù)研究JP2對(duì)SK2通道的功能調(diào)控奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料H9c2大鼠心肌細(xì)胞系為具有心肌功能的特異心肌樣細(xì)胞系，由鄭州大學(xué)藥理學(xué)系韓圣娜老師惠贈(zèng)。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，蛋白A/G瓊脂糖珠購自美國Sigma公司。兔多克隆抗SK2抗體購自以色列Alomone Labs公司，小鼠單克隆抗JP2抗體購自英國Abcam公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG購自美國BioRad公司。TRITC標(biāo)記的羊抗兔和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。蛋白濃度測定試劑盒和蛋白Marker均購自美國Thermo公司。

1.2H9c2細(xì)胞培養(yǎng)H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)90%DMEM高糖培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的完全培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3H9c2細(xì)胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫印跡檢測將H9c2細(xì)胞中加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心，獲得上清。同時(shí)取大鼠心肌組織裂解液作為陽性對(duì)照。95 ℃水浴5 min變性， 100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別用兔多克隆抗SK2抗體(1∶300)和小鼠單克隆抗JP2抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔及山羊抗鼠IgG(1∶14 000)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.4H9c2細(xì)胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫共沉淀檢測用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取H9c2細(xì)胞蛋白，將細(xì)胞蛋白樣品分為免疫共沉淀組、無關(guān)對(duì)照組及裂解液組3組。在免疫共沉淀組加入兔多克隆抗SK2抗體或小鼠單克隆抗JP2抗體，無關(guān)對(duì)照組中加入相對(duì)應(yīng)的同源無關(guān)抗體(兔多克隆抗IgG或小鼠單克隆抗IgG抗體)，4 ℃孵育過夜，加入蛋白A/G瓊脂糖珠4 ℃孵育過夜。RIPA裂解液清洗沉淀復(fù)合物以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物用2×Loading Buffer重懸后，95 ℃水浴5 min使蛋白變性，100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，進(jìn)行Western blot檢測。

1.5H9c2細(xì)胞中SK2通道和JP2蛋白的免疫熒光標(biāo)記檢測將H9c2細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)為0.1%TritonX-100處理，30 g/L BSA封閉，分別用兔多克隆抗SK2抗體和小鼠單克隆抗JP2抗體4 ℃孵育過夜，再分別用羊抗兔TRITC和羊抗鼠FITC標(biāo)記的二抗處理，激光共聚焦顯微鏡在543 nm波長處激發(fā)TRITC-羊抗兔標(biāo)記的樣本，488 nm波長處激發(fā)FITC-羊抗鼠標(biāo)記的樣本，350 nm波長處激發(fā)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，Merge為三者融合后的圖像。

2 結(jié)果

2.1H9c2細(xì)胞中SK2通道及JP2蛋白的表達(dá)以正常大鼠心肌組織裂解液作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示H9c2細(xì)胞蛋白樣品和心肌組織裂解液在60 000處均有免疫陽性條帶(圖1A)；H9c2細(xì)胞蛋白樣品和心肌組織裂解液在97 000處均有陽性條帶(圖1B)；與已報(bào)道[5-6]的SK2通道及JP2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符。

A：SK2通道表達(dá)；B：JP2蛋白表達(dá)；1：H9c2細(xì)胞；2：大鼠心肌組織裂解液

圖1H9c2細(xì)胞中SK2通道和JP2蛋白的表達(dá)

2.2H9c2細(xì)胞中SK2通道與JP2蛋白免疫共沉淀檢測結(jié)果見圖2。

A：H9c2細(xì)胞用抗JP2抗體進(jìn)行免疫共沉淀；B：H9c2細(xì)胞用抗SK2抗體進(jìn)行免疫共沉淀

圖2H9c2細(xì)胞中SK2與JP2的免疫共沉淀

將H9c2細(xì)胞裂解液加入抗JP2抗體孵育，無關(guān)對(duì)照組加入小鼠源無關(guān)IgG，經(jīng)蛋白A/G瓊脂糖珠孵育，抗SK2抗體檢測，免疫共沉淀組和裂解液組在60 000處可見陽性條帶，而無關(guān)對(duì)照組未見明顯條帶，說明H9c2細(xì)胞表達(dá)的JP2能被SK2結(jié)合。反之，采用抗SK2抗體進(jìn)行免疫共沉淀，無關(guān)對(duì)照組加入兔源無關(guān)IgG，抗JP2抗體檢測免疫沉淀物，免疫共沉淀組和裂解液組在97 000處可見陽性條帶，而無關(guān)對(duì)照組未見明顯條帶。上述結(jié)果說明H9c2細(xì)胞中SK2通道與JP2存在一定的相互作用。

2.3SK2通道與JP2蛋白在H9c2細(xì)胞的定位將培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，并分別采用抗SK2通道(紅色)和抗JP2抗體(綠色)孵育，激光共聚焦顯微鏡掃描觀察。Merge圖像橙色提示它們之間的共分布，可見SK2通道和JP2蛋白在H9c2細(xì)胞胞質(zhì)中存在部分共定位。見圖3。

圖3 H9c2細(xì)胞SK2和JP2的免疫熒光染色(×40)

3 討論

本研究采用分子生物學(xué)的方法，初步證實(shí)在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中存在SK2通道及JP2的表達(dá)，進(jìn)一步通過免疫共沉淀及免疫熒光標(biāo)記方法觀察到SK2與JP2蛋白可形成免疫沉淀復(fù)合物，二者在細(xì)胞質(zhì)中存在共定位，提示H9c2細(xì)胞中SK2通道與JP2具有相互作用。

SK2通道是存在于人和小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)參與動(dòng)作電位復(fù)極化末期的重要離子通道。在各類房顫中發(fā)現(xiàn)SK2通道可參與心房的電重構(gòu)。Li等[4]報(bào)道，敲除SK2通道的小鼠可出現(xiàn)動(dòng)作電位間期延長和房顫的易感性增加；而在快速型心率失常的兔肺靜脈中SK2通道細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加，復(fù)極化延長，促進(jìn)了房顫的發(fā)生[7]。因此，理解SK2通道的分子調(diào)控對(duì)研究心律失常等心臟疾病的治療有非常重要的意義。JP2是位于心肌耦聯(lián)膜復(fù)合體中重要的心臟特異性蛋白，在肥厚型心肌病患者中證實(shí)編碼JP2蛋白的基因發(fā)生突變，肌質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子異常[8-10]。以上研究結(jié)果提示JP2蛋白表達(dá)異常與心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。H9c2細(xì)胞株以大鼠胚胎心臟內(nèi)的心室組織為最初的細(xì)胞培養(yǎng)來源，是具有心肌功能的特異心肌樣細(xì)胞系，作為心臟成肌細(xì)胞常用于心肌疾病研究。He等[11]在H9c2細(xì)胞中研究了乙酰膽堿敏感的鉀離子通道的功能；Fretwell等[12]以外源的細(xì)胞系H9c2研究了大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的調(diào)控；本實(shí)驗(yàn)室之前采用免疫共沉淀及GST-pulldown等方法證實(shí)在小鼠心肌組織中SK2通道與JP2的MORN區(qū)存在相互作用[13]。但目前有關(guān)大鼠H9c2心肌細(xì)胞系中SK2通道與JP2的研究，仍未見報(bào)道。H9c2作為易于傳代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞系，心肌功能特征與體內(nèi)相似，為后續(xù)對(duì)心肌離子通道SK2功能進(jìn)行研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

JP2是偶聯(lián)細(xì)胞膜與肌質(zhì)網(wǎng)膜的關(guān)鍵蛋白分子。Golini等[14]研究證實(shí)，JP2偶聯(lián)鈣離子通道有重要的生理意義，JP1和JP2可與細(xì)胞膜上的L型鈣通道相互作用進(jìn)而調(diào)控鈣離子參與興奮-收縮偶聯(lián)過程。還有學(xué)者[15]報(bào)道，JP2與TRPC3鈣離子釋放通道偶聯(lián)并介導(dǎo)肌質(zhì)網(wǎng)通過蘭尼堿受體釋放鈣離子過程。而SK2通道作為細(xì)胞膜上通過細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變而實(shí)現(xiàn)功能的鉀離子通道，與JP2是否存在偶聯(lián)，本實(shí)驗(yàn)初步從結(jié)構(gòu)上探討了二者之間的相互作用。已有研究[16]證明了JP2在心肌鈣致鈣釋放過程中的重要作用，但是否因與SK2通道的相互作用而引起，尚不清楚。機(jī)體可興奮細(xì)胞的離子通道發(fā)揮正常生理功能主要依賴于細(xì)胞膜表面通道蛋白的數(shù)量和精確的定位[17]，JP2蛋白是否會(huì)影響心肌SK2通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)、定位及SK2通道功能，這些問題均需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，對(duì)于SK2通道和JP2蛋白的研究將有助于了解心肌疾病的發(fā)病機(jī)制，為房顫等心肌疾病防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。