生秀梅，黃新祥， 王正新

1)江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 江蘇鎮(zhèn)江 212013 2)克拉克亞特蘭大大學(xué)生物科學(xué)系；克拉克亞特蘭大大學(xué)癌癥研究與治療發(fā)展中心 美國亞特蘭大 30314

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一；目前肺癌的治療仍以手術(shù)為主，但術(shù)后預(yù)后差，生存期短，因此迫切需要找到新的診療方法或研制出新的診療試劑[1-2]。膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白1(glioma pathogenesis-related protein 1， GLIPR1)基因是從膠質(zhì)細(xì)胞瘤中克隆出來的新基因[3-4]，屬于富含半胱氨酸分泌蛋白CAP家族[5]。GLIPR1蛋白有一段信號肽和一段跨膜區(qū)段，被認(rèn)為是一種分泌蛋白[5-6]。在前列腺癌和膀胱癌等腫瘤中，GLIPR1具有抑癌作用，受p53調(diào)節(jié)，其過表達(dá)可誘導(dǎo)多種前列腺腫瘤細(xì)胞的凋亡[7-9]。有報(bào)道[10]指出GLIPR1在正常肺細(xì)胞中表達(dá)較高，但在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)較低。因此，本研究擬通過慢病毒感染使肺癌A549細(xì)胞高表達(dá)GLIPR1蛋白或GLIPR1胞外可溶性區(qū)段(GLIPR1-S)，探索GLIPR1對A549細(xì)胞生長和分化的影響，以期為肺癌藥物的研制提供線索。

1 材料與方法

1.1材料pCDH-FLAG由本室構(gòu)建(構(gòu)建所用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒載體系統(tǒng)購自SBI公司)；A549細(xì)胞、293T細(xì)胞及E.coliXL 10-gold感受態(tài)細(xì)胞由本室保存。人GLIPR1cDNA克隆 (HsCD00441029) 購自DNASU公司，肺表面活性蛋白C(SPC)抗體購自Millipore公司，anti-β-actin抗體購自Sigma公司，二抗山羊抗大鼠Alexa 595抗體購自Invitrogen公司，anti-GLIPR1抗體購自Abnova公司，細(xì)胞染色劑SYTOX GREEN購自美國Molecular Probes公司，Histogel凝膠購自Linaris公司。

1.2GLIPR1、GLIPR1-S重組慢病毒載體的構(gòu)建根據(jù)GLIPR1序列(HQ447422)設(shè)計(jì)并合成上下游引物，分別在上下游引物的5’端加接EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列；為了增加蛋白的表達(dá)，在上游引物GLIPR1起始密碼子AUG前添加ACC堿基[11-13]。GLIPR1、GLIPR1-S共用同一上游引物GLIPR1-F：5’-GGAATTCACCATGCGTGTCACACTT GCTACAATAG-3’ (下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物GLIPR1-R：5’-CGGGATCCTGAATTGTATT AGTCCAAAAG-3’，GLIPR1-S-R：5’-CGGGATCCTTATCTGTTACGTGGATATATGGGCC -3’(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))。以含有GLIPR1 cDNA克隆的質(zhì)粒為模板，分別以GLIPR1-F/R及GLIPR1-F/GLIPR1-S-R為引物，通過PCR獲取目的基因GLIPR1和GLIPR1-S。膠回收后和pCDH-FLAG分別經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶室溫連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliXL 10-gold，次日從含氨芐西林的LB平板上挑取6個(gè)菌落，接種于4 μL含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切驗(yàn)證及DNA測序分析最終確認(rèn)，分別為pCDH-GLIPR1-FLAG和pCDH-GLIPR1-S-FLAG。

1.3重組慢病毒的包裝及濃縮應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCDH-GLIPR1-FLAG和pCDH-GLIPR1-S-FLAG質(zhì)粒、包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G按質(zhì)量比4∶3∶1的比例混合，共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基10 mL，48 h后，收集細(xì)胞上清液(含慢病毒Lenti-GLIPR1、Lenti-GLIPR1-S)，用0.45 μm濾膜過濾掉細(xì)胞殘片，密封后4 ℃保存。分別用1、5、10、30、50、100 μL的病毒液，感染均勻平鋪于6孔板的293T細(xì)胞，72 h后通過觀察細(xì)胞的熒光效率測得病毒滴度為6×109PFU/mL。

1.4重組慢病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞活力測定將A549細(xì)胞接種于24孔板，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。第2天細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，換含上述2種重組慢病毒顆粒懸液30 μL的新鮮培養(yǎng)基1 mL，加入終濃度為8 mg/L的Polybrene以增加感染效率。同時(shí)設(shè)立Lenti-pCDH空病毒組。轉(zhuǎn)染16 h后，換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。感染第3天轉(zhuǎn)至100 mm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.5感染重組慢病毒的A549細(xì)胞GLIPR1和GLIPR1-S蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法。 收集1.4中細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解后離心取上清，測定濃度后，以各泳道上樣量10 μg進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用含30 g/L脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，分別用多克隆抗體anti-GLIPR1(1∶1 000稀釋)、anti-β-actin(1∶5 000稀釋)和對應(yīng)的二抗進(jìn)行免疫標(biāo)記，ECL顯色，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.6感染重組慢病毒的A549細(xì)胞的分化情況觀察采用免疫細(xì)胞化學(xué)法。 將Lenti-GLIPR1或Lenti-pCDH空病毒感染的A549細(xì)胞接種于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。第2天，吸去培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞后，用冷甲醛(-20 ℃)固定10 min， 體積分?jǐn)?shù)4%魚膠(PBS配制)阻斷非特異性染色，20 min后移去魚膠，加SPC抗體(1∶50稀釋)、anti-GLIPR1抗體(1∶100稀釋，魚膠配制)孵育過夜，加山羊抗大鼠Alexa 595抗體(1∶500稀釋) ，室溫孵育1 h， PBS洗細(xì)胞后，用SYTOX GREEN室溫對比染色10 min，用Histogel封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1pCDH-GLIPR1及pCDH-GLIPR1-S的鑒定通過PCR擴(kuò)增分別獲得全長813 bp的GLIPR1片段和711 bp的GLIPR1-S片段。將目的片段插入慢病毒載體pCDH構(gòu)建成pCDH-GLIPR1和pCDH-GLIPR1-S，轉(zhuǎn)化E.coliXL 10-gold，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，電泳可見800 bp和700 bp左右的片段，DNA測序亦完全正確，表明pCDH-GLIPR1和 pCDH-GLIPR1-S構(gòu)建成功，見圖1。

1:GLIPR1-S擴(kuò)增產(chǎn)物；2：GLIPR1擴(kuò)增產(chǎn)物；M：Marker；3：pCDH-GLIPR1-S酶切結(jié)果；4：pCDH-GLIPR1酶切結(jié)果

圖1重組慢病毒載體的構(gòu)建(左)和酶切鑒定(右)

2.2感染重組慢病毒的A549細(xì)胞GLIPR1和GLIPR1-S蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示A549細(xì)胞經(jīng)Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S感染后，均可表達(dá)相應(yīng)蛋白(圖2)。

1：空病毒組；2：感染Lenti-GLIPR1組；3：感染Lenti-GLIPR1-S組

圖2Westernblot檢測結(jié)果

2.3感染重組慢病毒的A549細(xì)胞的生長分化情況與空病毒組[(63.872±6.376)×105]相比，感染Lenti-GLIPR1、Lenti-GLIPR1-S第6天的A549細(xì)胞數(shù)分別為(7.167±1.750)×105和(2.167±1.102)×105，說明感染后細(xì)胞生長受抑(F=235.500,P<0.001)。與空病毒組相比，感染Lenti-GLIPR1 的A549細(xì)胞明顯變大(圖3A、B)。共聚焦顯微鏡下可見GLIPR1主要定位于A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(綠色為核，紅色為GLIPR1， 圖3C)，細(xì)胞中SPC增多(圖4，綠色為核，紅色為SPC)，說明GLIPR1表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞向肺上皮細(xì)胞分化。

A：空病毒組(×400)；B：感染Lenti-GLIPR1組(×400)；C：GLIPR1在感染Lenti-GLIPR1的A549細(xì)胞中的分布(免疫熒光染色)

A：空病毒組；B：感染Lenti-GLIPR1組

3 討論

GLIPR1蛋白又稱RTVP-1，是富含半胱氨酸分泌蛋白CAP家族的一員[5]。GLIPR1蛋白包含一段信號肽和一段跨膜區(qū)段。氨基末端的前21個(gè)氨基酸殘基組成了GLIPR1前體蛋白的信號肽，而羧基末端的氨基酸殘基則構(gòu)成了跨膜區(qū)段[5,14]。GLIPR1早期作為原癌基因發(fā)現(xiàn)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中[3],其高表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、存活、侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。但是，在前列腺癌細(xì)胞中，GLIPR1表達(dá)較低，為p53調(diào)節(jié)基因，GLIPR1的高表達(dá)可產(chǎn)生活性氧，從而導(dǎo)致多種前列腺腫瘤細(xì)胞的凋亡[7-9]。將腺病毒載體介導(dǎo)的GLIPR1基因直接注射于鼠前列腺癌組織可抑制腫瘤組織的生長[16]。亦有用腺病毒載體介導(dǎo)的GLIPR1基因疫苗治療鼠前列腺腫瘤的研究[17]。為了檢測可溶性GLIPR1區(qū)段是否具備GLIPR1的抑癌活性，本研究同時(shí)構(gòu)建了重組慢病毒Lenti-GLIPR1-S(GLIPR1去除跨膜區(qū)段)，其蛋白包括GLIPR1蛋白的前1～232個(gè)氨基酸殘基。結(jié)果顯示，感染Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S的A549細(xì)胞中GLIPR1蛋白的表達(dá)均升高，而A549細(xì)胞的生長受抑；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GLIPR1高表達(dá)可使A549細(xì)胞變大，促進(jìn)細(xì)胞中SPC的表達(dá)，提示A549細(xì)胞向肺上皮細(xì)胞分化。推測感染Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S均可促進(jìn)A549細(xì)胞向肺上皮細(xì)胞分化，抑制A549細(xì)胞的生長。后續(xù)研究可著重于使用可溶性GLIPR1蛋白進(jìn)行臨床藥物研制。