李蓮梅，余博文，畢建朋，王曼華

1)青海省婦女兒童醫(yī)院感染消化科 西寧 810000 2)西寧市城西區(qū)疾病控制中心疾控科 西寧 810000 3)鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 (河南省兒童醫(yī)院；鄭州兒童醫(yī)院)泌尿外科 鄭州 450052 4)河南廣播電視大學(xué)農(nóng)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046

肺炎是5歲以下兒童死亡的重要原因之一[1]。肺炎鏈球菌是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要病原。肺泡上皮細(xì)胞可以合成和分泌多種活性物質(zhì)，參與肺炎發(fā)生過(guò)程。肺泡上皮細(xì)胞可以分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有維持肺組織正常功能、分泌肺泡表面活性物質(zhì)等作用，與肺炎發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等多種病理生理過(guò)程，在肺炎引起的肺損傷中發(fā)現(xiàn)肺組織中TLR4高表達(dá)，TLR4在內(nèi)毒素、脂多糖等誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討TLR4在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用，以期為明確肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料肺炎鏈球菌R6購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，細(xì)胞色素C(Cytochrome C)抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，胞漿蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，qRT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，TLR4 siRNA慢病毒和siRNA陰性對(duì)照慢病毒、TLR4抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞分組和培養(yǎng)A549細(xì)胞分成4組：對(duì)照組(不用肺炎鏈球菌誘導(dǎo)刺激)、肺炎鏈球菌組(培養(yǎng)細(xì)胞密度為70%時(shí)，在細(xì)胞中添加1×107CFU/L的肺炎鏈球菌進(jìn)行誘導(dǎo)刺激)、siRNA-NC組(肺炎鏈球菌誘導(dǎo)刺激A549細(xì)胞后，感染siRNA陰性對(duì)照慢病毒)和siRNA-TLR4組(肺炎鏈球菌誘導(dǎo)刺激A549細(xì)胞后，感染TLR4 siRNA慢病毒)，每組均設(shè)5個(gè)平行對(duì)照。4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)沉默效果。

1.3 4組細(xì)胞中TLR4mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè)用總RNA提取試劑盒分別提取4組細(xì)胞中的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qRT-PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，熒光預(yù)變性反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。按照2-ΔΔCt法分析各組細(xì)胞中TLR4 mRNA水平。TLR4上游引物序列5’-AGAGCTGAAATG GAGGCACC-3’，下游引物序列5’-AGGACCAGAG GCAGCTCTTG-3’；β-actin上游引物序列5’-TCATT GACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 4組細(xì)胞中TLR4、CleavedCaspase-3、細(xì)胞胞漿和線粒體中CytochromeC蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)4組細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次后，分別添加細(xì)胞裂解液，放在冰上裂解約30 min，收集裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到EP管，4 ℃離心后，把上層溶液(蛋白上清液)轉(zhuǎn)移到EP管中，保存在-70 ℃冰箱。蛋白濃度檢測(cè)按照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒。蛋白樣品變性(與Loading Buffer混合煮沸5 min)處理以后，分別添加到凝膠樣品孔內(nèi)，設(shè)置濃縮膠中電壓為60 V，分離膠中電壓為120 V。把凝膠取出，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中孵育15 min，再把PVDF膜置于甲醇溶液中充分浸泡10 min。轉(zhuǎn)膜置于4 ℃中進(jìn)行，設(shè)置120 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min，用50 g/L牛血清白蛋白常規(guī)封閉以后，與TLR4(按1∶200稀釋)、Cleaved Caspase-3(按1∶100稀釋)和Cytochrome C(按1∶200稀釋)一抗置于4 ℃中反應(yīng)過(guò)夜后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(按1∶4 000稀釋)在室溫條件下孵育結(jié)合90 min，ECL法化學(xué)發(fā)光，Odyssey FC顯影，利用LabWorks 4.5對(duì)各蛋白進(jìn)行定量(內(nèi)參為β-actin)。

1.5 4組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組細(xì)胞按照1.2方法處理培養(yǎng)24 h以后，加入冰預(yù)冷的PBS重懸，離心后，用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，添加Annexin V-FITC和PI混合后，置于室溫中孵育15 min。立即用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較4組細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白、胞漿和線粒體中Cytochrome C表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞中TLR4mRNA和蛋白表達(dá)變化見(jiàn)圖1和表1。由圖1和表1可知，TLR4 siRNA慢病毒感染可有效降低肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理的A549細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

1：對(duì)照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

組別TLR4 mRNATLR4蛋白對(duì)照組1.00±0.090.21±0.02肺炎鏈球菌組1.89±0.13#0.59±0.06#siRNA-NC組1.87±0.120.57±0.05siRNA-TLR4組0.85±0.07*0.26±0.03*F83.380 65.120 P<0.001 <0.001

#：與對(duì)照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

2.2 4組細(xì)胞凋亡和CleavedCaspase-3蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。由表2可知，A549細(xì)胞經(jīng)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，而沉默TLR4表達(dá)的A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低。

1：對(duì)照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

組別凋亡率/%Cleaved Caspase-3對(duì)照組5.69±0.780.20±0.03肺炎鏈球菌組38.26±3.47#0.62±0.05#siRNA-NC組39.52±2.140.60±0.07siRNA-TLR4組24.17±3.82*0.42±0.05*F47.340 42.370 P<0.001 <0.001

#：與對(duì)照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

2.3 4組細(xì)胞胞漿和線粒體中CytochromeC蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。由表3可知，A549細(xì)胞經(jīng)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞胞漿中Cytochrome C蛋白表達(dá)水平升高，線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá)水平降低。沉默TLR4表達(dá)的A549細(xì)胞胞漿中Cytochrome C蛋白表達(dá)水平降低，線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá)水平升高。

上：胞漿中Cytochrome C蛋白的表達(dá)；下：線粒體中Cytochrome C蛋白的表達(dá)；1：對(duì)照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

圖3 4組細(xì)胞胞漿和線粒體中Cytochrome C蛋白的表達(dá)

#：與對(duì)照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

3 討論

肺泡上皮細(xì)胞存在于肺泡表面，可分為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，二者存在于同一個(gè)基底膜，共同構(gòu)成肺上皮屏障，能夠維持肺泡相對(duì)干燥、清除肺泡過(guò)多液體。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞占肺泡細(xì)胞的16%，僅覆蓋了肺泡總面積的5%左右，其具有跨膜運(yùn)輸、分泌活性物質(zhì)的作用，參與氧化代謝等過(guò)程；其既可以增殖產(chǎn)生新的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，又可以分化成Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞。有研究[6-7]表明，肺炎發(fā)生與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)。肺炎鏈球菌是小兒肺炎發(fā)生的重要病原體，其可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而影響肺組織正常功能的發(fā)揮[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理后的肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡增多，提示肺炎鏈球菌可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，這與上述報(bào)道一致。

TLR4是與天然免疫密切相關(guān)的受體，其屬于Toll受體家族。TLR4分子含有胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和穿膜區(qū)，其胞外區(qū)含有豐富的亮氨酸，能夠與CD14分子序列結(jié)合而影響蛋白質(zhì)之間的相互作用；胞內(nèi)區(qū)為一段保守的序列，其與白細(xì)胞介素1受體的胞內(nèi)區(qū)同源性極高，因此，TLR4又屬于白細(xì)胞介素1受體超家族成員[8-10]。有研究[11-14]顯示，TLR4在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等各種類(lèi)型的細(xì)胞中存在，在肺臟、胎盤(pán)、脾臟等組織中廣泛表達(dá)；TLR4參與細(xì)胞正常生理功能發(fā)揮，并且與腫瘤、肺炎、糖尿病等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。多個(gè)研究[5-6,15]表明，TLR4在肺炎大鼠肺組織中高表達(dá)；在脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中同樣發(fā)現(xiàn)TLR4高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理后的肺泡上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平升高，沉默TLR4可以明顯抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，提示沉默TLR4在肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

線粒體凋亡途徑是目前發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的經(jīng)典凋亡途徑，其在心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中均廣泛存在，線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵是線粒體中Cytochrome C的釋放，線粒體受到外界因素刺激以后，線粒體膜電位下降，使存在于線粒體中的Cytochrome C進(jìn)入到胞漿中，而Cytochrome C可以同胞漿中Caspase反應(yīng)，誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[16-17]。Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志，也是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默TLR4后肺泡上皮細(xì)胞線粒體中Cytochrome C蛋白水平升高，胞漿中Cytochrome C蛋白水平降低，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平降低，提示沉默TLR4可能通過(guò)線粒體途徑抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，TLR4參與肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程，沉默TLR4的表達(dá)可減少肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有在原代肺泡上皮細(xì)胞和體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行探討。